Приготовленные, как описано выше, мазки покрывают фильтровальной бумагой и наносят 1,5–2,0 мл карболового фуксина па один мазок, затем медленно нагревают предметное стекло с мазком над пламенем горелки по появления пара.
При этом не допускают кипение фуксина и высушивание материала. Мазок с прогретым раствором оставляют на 5 минут. Затем удаляют фильтровальную бумагу и аккуратно смывают остатки краски со стекла проточной водой.
Обесцвечивание проводят 25% раствором серной кислоты (2 мл на мазок) в течение З минут. Затем стекло промывают проточной водой и дополнительно обрабатывают 96% этиловым спиртом (2 мл на мазок) в течение 5 минут. Гашение фона достигается обработкой 0,3% раствором метиленового синего в течение 30–60 секунд.
Приготовление растворов
(Все растворы готовятся с использованием дистиллированной воды)
1). Насыщенный спиртовой раствор фуксина: основной фуксин – 3 г растворяют в – 100 мл 96% этилового спирта.
2). Рабочий раствор фуксина: кристаллы фенола 5 г медленно нагревают до расплавления, доливают 90 мл воды, затем в полученный раствор фенола добавляют 10 мл насыщенного раствора фуксина.
3). 25% серная кислота: в 300 мл воды доливают 100 мл 98% (концентрированной) серной кислоты. Данная манипуляция проводится с крайней осторожностью!
4). 0,3% метиленовый синий: 0,3 г метиленового синего растворяют в 100 ил воды.
Для исследования окрашенных мазков используют бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом (х90 или х100 объектив, 7–10 окуляр). Исследуют не менее 100 микроскопических полей зрения в течение 5 минут. Ели МБТ не обнаружены, исследуют еще 100 полей зрения. Микобактерии выглядят как тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1–4 мкм и диаметром 0,2–0,5 мим, рубинового цвета, иногда с выраженной зернистостью.
Для культивирования микобактерии туберкулеза используют различные питательные среды: плотные, полужидкие, жидкие (синтетические и полусинтетические). Однако ни одна из них не обладает качествами, предъявляемыми к ним современной бактериологической диагностикой туберкулеза. В связи с этим для повышения результативности культурального метода рекомендуется применять посев патологического материала одновременно на несколько (2–3) питательных сред. Для выделения чистых культур микобактерии туберкулеза чаще всего применяют различные по составу плотные питательные среды. В качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя и определения его лекарственной чувствительности ВОЗ рекомендована среда Левенштейна – Йенсена. Это плотная яичная среда, на которой хороший рост микобактерии туберкулеза получают на 15–25-й день после посева бактериоскопически положительного материала.
В последние годы широкое распространение в нашей стране получила яичная среда II, предложенная Э.Р. Финном (среда Финна-II). Она отличается от среды Левенштейна – Йенсена тем, что вместо b-аспарагина в ней используется глутамат натрия. На этой среде рост микобайтерий туберкулеза появляется на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна – Йенсена. Процент выделения культур на этой среде на 6–8% выше, чем на среде Левенштейна – Йенсена.
Для повышения вероятности получения роста микобактерии рекомендуется засевать патологический материал на 2–3 различные по составу питательные среды одновременно. В настоящее время, кроме безаспарагиновой среды Финна-И, в практику внедряется еще одна безаспарагиновая среда, разработанная В.А. Аникиным. По данным Московского НИИ туберкулеза, применение сред, сбалансированных по солевому составу и источникам азотистого питания иначе, чем среда Левенштейна – Йенсена, культуральная диагностика туберкулеза улучшается в среднем на 6,7%. Это особенно важно при таких формах туберкулеза, при которых возбудитель паразитирует в условиях ацидоза и анаэробиоза, в частности, при туберкулезе мочеполовых органов.
Для повышения результативности культурального метода наряду с применением одновременно нескольких различных по составу питательных сред для посева рекомендуется повторное многократное исследование материала, так как в настоящее время отмечается состояние олигобациллярности у большинства больных даже со свежевыявленными деструктивными поражениями в легких. Олигоба-циллярность проявляется не только малым количеством возбудителей в диагностическом материале, но и транзиторностью, эпизодичностью их выделения. Поэтому часто посев даже на 3 различные питательные среды не обеспечивает полной информации о состоянии бактериовыделения.
Для повышения информативности культурального метода практикуется повторное многократное исследование материала от больных. По данным Центрального НИИ туберкулеза, методика 3-кратного первичного комплексного исследования бактериоскопическими и культуральными методами у впервые выявленных больных деструктивным туберкулезом легких дает дополнительно 3,4% положительных результатов, а у больных хроническим деструктивным туберкулезом, лечившихся до поступления в стационар, – 5,8% по сравнению с данными одноразового исследования. Однако, по данным ряда авторов, и 3-кратные посевы недостаточны для выявления истинной картины бактериовыделения. Так, установлено, что при обследовании нелечившихся больных максимальный прирост информации о бактериовыделении можно получить при 6-кратных повторных посевах материала, при этом количество положительных результатов возрастает на 36–37% по сравнению с данными 3-кратного посева. У больных после 3-месячного лечения ценность многократного исследования патологического материала методом посева возрастает и при 6-кратном исследовании показатель прироста положительных результатов может достигать 70%, а после 6 мес. лечения он возрастает до 82%.
Таким образом, кратность исследования и состав питательных сред имеют важное значение для культуральной диагностики туберкулеза.
В связи с тем что в процессе интенсивной химиотерапии происходит повреждение различных метаболических систем микробной клетки, ряд микроорганизмов в микобактериальной популяции утрачивает способность нормально развиваться на питательных средах. Отмечается снижение жизнеспособности микобактерий, что может проявляться отсутствием роста на общепринятых питательных средах, а также возникновением способности расти только на осмотически сбалансированных (полужидкие или даже жидкие) питательных средах. Так, по данным И.Р. До рожковой, в процессе интенсивной противотуберкулезной химиотерапии часть микобактериальной популяции, утрачивая способность расти на плотных питательных средах, в то же время приобретает свойство расти на полужидких питательных средах, образуя микроколонии в верхнем наиболее аэрируемом участке питательной среды. Эта потребность в повышенной аэрации четко проявляется также при культивировании микобактерий в жидких питательных средах с увеличенной аэрацией, которая достигается при культивировании посевов во вращающемся термостате (Н.М. Макаревич).
После посева и закрытия пробирок материал должен быть распределен по всей поверхности питательной среды, для этого пробирки наклоняют. Пробирки должны находиться в горизонтальном положении в течение 24–48 ч, после чего их следует перевести в вертикальное положение.
Посевы нужно просматривать еженедельно. При этом обязательно регистрируются параметры: а) появление роста – срок появления, начиная со дня посева; б) интенсивность роста – число колоний, этот показатель имеет большое диагностическое и прогностическое значение, особенно если посевы производятся в динамике; в) загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами; г) отсутствие роста.
При первичном посеве бактериоскопически отрицательного материала на плотные среды средняя продолжительность роста составляет 20–46 дней. Отдельные штаммы растут 60 и даже 90 дней. Это заставляет выдерживать посевы в термостате в течение 3 мес., еженедельно проверяя появление роста.
Обычно вирулентные культуры микобактерий туберкулеза растут на плотных питательных средах в виде R-форм колоний различной величины и вида. Колонии сухие, морщинистые, цвета слоновой кости, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых резко отличается от оранжевого или желтого пигмента сапрофитных или атипичных микобактерий. Последние обычно растут в S-форме. Следует отметить, что на среде Финна-II колонии микобактерий туберкулеза могут быть более влажными.
После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы). Гладкие колонии характерны также для Mycobacterium bovis, которые также патогенны для человека.
Положительный ответ дают только после микроскопии мазка из выросших колоний, окрашенного по Цилю–Нильсену. В мазках обнаруживаются ярко- и темно-красные палочки, лежащие одиночно или группами, образующие переплетения в виде «войлока» или «кос», часто видны темные зерна, особенно в длительно растущих культурах. В молодых культурах микобактерий туберкулеза (особенно выделенные от больных, длительно леченных химиопрепаратами) часто отличаются большим полиморфизмом, вплоть до появления коротких, почти кокковидных форм.
Интенсивность роста обозначают по 4-балльной системе: + единичные колонии; ++ от 20 до 100 колоний; +++ от 100 до 200 колоний; мм несосчитываемое число колоний (сливной рост). В двух последних случаях имеется обильное бактериовыделение, которое является показателем активности процесса и / или неэффективности лечения.
Если морфология колоний или палочек вызывает сомнения в их туберкулезной природе или культуры выделены из материала, который может содержать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и др.), мазки дополнительно обесцвечивают спиртом (в течение 45–60 мин) или жавелевой водой (в течение 1–2 ч). Следует учитывать, что молодые культуры микобактерий туберкулеза могут обесцвечиваться спиртом и жавелевой водой, так как они еще слабо кислотоустойчивы. В таких случаях культуры следует выдержать еще несколько дней (5–10) в термостате и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их кислотоустойчивости.
Авирулентные сапрофитные и атипичные микобактерий обычно грубее, толще, иногда менее интенсивно окрашены и, как правило, не образуют жгутообразных сплетений (корд-фактор отсутствует). Однако некоторые виды атипичных микобактерий (фотохромогенные) могут расти в R-форме. Многие атипичные и сапрофитные микобактерий имеют кислотоустойчивые зерна, весьма сходные с таковыми у вирулентных микобактерий туберкулеза.
В тех случаях, когда выделяются культуры, вызывающие сомнения в плане их принадлежности к микобактериям туберкулеза, их изучают, используя комплекс специальных исследований, позволяющих дифференцировать типичные микобактерий туберкулеза от нетуберкулезных (атипичных) микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов.
Как отмечалось выше, в случае появления на питательных средах роста колоний и установления с помощью микроскопии окрашенных по Цилю–Нильсену мазков факта, что выросшая культура относится к кислотоустойчивым микобактериям, производится количественная оценка результатов посева. С этой целью применяют различные схемы оценки (одна из них приведена выше). В Центральном НИИ туберкулеза используют количественную оценку бактериовыделения методом посева по 3 степеням: 1) скудное – на плотных питательных средах вырастает 1–20 колоний во всех пробирках, использованных для данного посева; 2) умеренное – от 21 до 100 колоний во всех пробирках; 3) обильное – обнаруживается рост более 100 колоний во всех пробирках.
Таксономическая характеристика – Четыре группы микобактерий
Первая группа – фотохромогенные микобактерии
Вырастают в темноте беспигментными (в термостате) в течение 3–6 недель, но после освещения дневным или электрическим светом приобретают пигмент желтого или желто-оранжевого цвета. К ним относятся: М. kansasii, М. simiае, М. balnеi. Наибольшее значение в легочной диагностике имеют М. kansasii.
М. kansasii (М. lucitlavum) выделены и описаны Булер и Поллак в 1953 г. как возбудитель заболеваний людей. На яичной среде растут в виде шероховатых или гладких колоний, температурный оптимум 37°С.
Морфологические бактерии умеренной длины. Описаны 2 варианта М. kansasii: оранжевый (auranticum) и белый (album). Отличаются они только способности образовывать пигмент, который зависит от наличия каротиноидов. Остальные свойства указанных вариантов – одинаковы.
При введении морским свинкам вызывают инфильтраты и уплотнения регионарных лимфоузлов. Встречаются в водоемах. Природный источник не установлен.
Вторая группа – скотохромогенные микобактерии
Образуют желто-оранжевый пигмент при росте в темноте, растут медленно 30–60 дней. К ним относятся М. aquae (М. gordonae), М. scrofulaceum.
М. scrofulaceum выделены Приссик, Массой (1958) из гноя лимфатического узла ребенка с лимфаденитом. На яичной среде растут в виде оранжевого цвета гладких или шероховатых колоний. Морфологически короткие или длинные палочковидные формы. Растут при 25–37°С. Вызывают у детей поражения лимфоузлов и легких.
М. aquae (М. gordonae, Tab-water scotochromogen – скотохромогены водопроводной воды). Выделены и описаны Бойялил с сотр. (1962). На яичной среде растут в виде оранжевых колоний при 25–37°С. Морфологически палочковидная форма умеренной длины (приблизительно 0,5 мкм). Обнаружены в водоемах. Для лабораторных животных не патогенны.
Третья группа нефотохромогенные микобактерии
Данные микобактерии не образующие пигмента или имеющие бледно-желтую окраску, которая не усиливается под воздействием света. Растут в течение 2–3-х или 5–6-ти недель. К ним относятся М. avium, М. xenopi, М. terrae, М. gastri, М. intracellulare, М. hattey, М. bruiiense. Последние описаны Куттино, Мак Кабе, Раньон (1965). М. avium дают рост на среде Левенштейна-Йенсена в виде пигментированных колоний при 37°С и 45°С. Морфологически – средней длины палочки. Патогенны для человека и для ряда лабораторных животных, а также для домашних животных (например, свиней). Встречаются в воде, в почве.
М. xenopi (М. littorale). Описаны Швабахер (1959). Выделены от жабы. Молодые культуры растут в виде непигментированных колоний; позднее появляется пигмент желтого цвета. Морфологически – длинные нитевидные палочки. Растут при 40°–45°С, патогенны для человека.
М. terrae (Radish bacillus) бациллы редьки. Описаны Вайном (1966). Растут на среде Левенштейна-Йенсена в виде бес пигментных колоний. Оптимум роста 37 °С. Морфологически – палочка умеренной длины. Чаще всего для человека не патогенна. Встречается в окружающей нас природе.
Четвертая группа – быстрорастущие микобактерии
Растут в виде пигментных или бес пигментных колоний, чаще в виде R-формы. Хороший рост дают в течение 2–5 дней при 25°С. К этой группе относятся потенциально патогенные микобактерии М. fortuitum и такие сапрофиты, как М. phlei, М. sniegmatis и др.
М. fortuitum (М. minetti, М. giae) выделены и описаны Круз (1933), Пенсо (1952). Рост в субкультурах на личной среде появляется на 2–4-й день в виде «розетки». Морфологически – короткие палочки. На среде Левенштейна–Йенсена могут поглощать краску и окрашиваться в зеленый цвет. Условно – патогенные для человека. Сапрофитные микобактерии широко распространены в природе.