3.4.1. Измерение поперечных размеров микрообъекта.
Это измерение проводится следующим образом:
а) поместить предметное стекло с препаратом на столик микроскопа. Передвинуть столик препаратоводителем 1-2 (рис.7) так, чтобы в поле зрения попал нужный фрагмент препарата, подлежащий измерению (например, отдельный эритроцит). Навести его изображение на резкость рукоятками 7-8 (рис. 6);
б) вставить вместо обычного окуляра измерительный окуляр 12× и навести его шкалу на резкость. Совместить изображение измеряемого объекта со шкалой окуляра. Определить поперечный размер объекта, зная цену деления шкалы окуляра (см. п. 3.2.4).
в) при использовании цифровой видеотрансляции измерение поперечных размеров не требует использования измерительного окуляра. Вместо этого после сохранения изображения микрообъекта следует войти в папку «Метрология микроскопа» (расположена на рабочем столе компьютера) и вызвать изображение микрометрической шкалы, полученное при использовании объектива 40×. Цена деления шкалы 10 мкм, поэтому при наложении её изображения на изображение микрообъекта при использовании того же объектива можно непосредственно измерять все поперечные размеры объекта, а при использовании другого объектива применять пересчёт согласно таблице 1.
3.4.2. Определение оптической разности хода.
Измерение дифференциальным методом (призма № 1)
Измерение оптической разности хода основано на выделении фрагментов объекта, имеющих соответствующую окраску.
Следует вначале настроить ДПП на окрашенный в определенный цвет фон и отметить отсчет р0 на шкале микровинта рукоятки 11 (рис. 6). При этом в изображении объекта выделяются места, окрашенные в цвета, отличные от фона. Чтобы определить разность хода Ψ в выбранном месте объекта, необходимо перестроить ДПП поворотом рукоятки 11 до такого положения, при котором выбранное место примет ту же окраску, что и фон при первоначальной настройке. Произведя отсчет р1 в этот момент настройки, можно определить искомую разность хода по формуле
(6)
Измерение методом полос (призма № 2).
Этот метод целесообразно применять тогда, когда поперечный размер объекта, вносящего искажения в картину интерференционных полос, мал (порядка 1/10 видимой ширины полосы или менее). Для такого объекта затруднительно применить дифференциальный метод, поскольку идентифицировать цвет в столь малой области поля зрения практически невозможно. Поэтому объект наблюдается на фоне картины полос в двойном изображении, причем так, чтобы его изображения были симметричны относительно выбранной прямой, в качестве которой можно взять середину некоторой темной полосы (см. рис. 3, а).
Малый предмет, форму которого в первом приближении можно считать овальной (например, отдельный эритроцит), воспроизводит на себе картину полос в искаженном виде, так что примерно в средней части его обозначается аналог выбранной темной полосы. Смещение l полосы можно измерить с помощью отсчета по шкале измерительного окуляра 12Х, цена деления которого определена при калибровке (см. п. 3.2.4), либо с помощью перемещения картины полос и отсчета по шкале микровинта рукоятки 11, согласно п. 3.2.5. Искомая разность хода Ψ определяется по формуле
(7)
Заметим, что точность измерения смещения полосы можно повысить, производя отсчет l как для «обыкновенного», так и для «необыкновенного» изображений предмета и усредняя полученные значения. Строго говоря, это следует делать всегда, иначе факт раздвоенности изображений оказывается невостребованным.
Описанный способ измерения оптической разности хода, наиболее подходящий для исследования малых квазиовальных объектов, может быть с успехом применен и для удлиненных объектов малой поперечной толщины (волокон, тонких пленок, канавок и т. п.). В этом случае удлиненный объект следует расположить под углом к системе полос, близким к 45 градусам (см. рис. 3, б). Вследствие малой поперечной толщины объекта величина смещения l может быть в данном случае измерена с бóльшей точностью, чем для малого квазиовального объекта. При прямом визуальном контроле можно измерять таким способом оптическую разность хода с точностью порядка λ/10.
Даже без применения компьютерной обработки изображений после фотографирования интерференционного изображения и измерения смещения полос с применением оптического денситометра можно повысить точность по крайней мере на порядок. Таким образом, распространённое мнение о том, что масштабы расстояний, меньших длины волны, недоступны для микроскопии по причине волновой природы света, решительно опровергается именно методами волновой оптики.
Определение показателя преломления биообъектов,
находящихся в жидкой среде.
Измерение производится методом полос (призма № 2).
Настроив изображение объекта аналогично (3.4.2.), следует определить, как отличается показатель преломления исследуемого объекта от показателя преломления окружающей среды. Для этого следует установить раздвоенные изображения объекта симметрично относительно нулевой полосы (темной полосы нулевого порядка интерференции). Перемещая ДПП рукояткой 11 (см. рис 6), можно обнаружить затемнение одного из изображений.
Если наблюдается «правило дружбы», т.е. соответствующее изображение затемняется со своей стороны от нулевой полосы, то показатель преломления исследуемого объекта меньше, чем показатель преломления окружающей среды. Соответственно, при «отсутствии дружбы» картина обратная.Если измерить теперь вышеописанным способом оптическую разность хода для исследуемого объекта по отношению к окружающей среде, то она должна быть связана с его показателем преломления формулой:
, (8)
где n и n1 – показатели преломления исследуемого объекта и окружающей среды соответственно, t – геометрическая толщина исследуемого объекта.
Заметим, что Ψ меняет знак в зависимости от соотношения между показателями преломления n и n1. Следовательно, чтобы не совершить ошибки при последующем измерении, необходимо сначала применить «правило дружбы», описанное выше. Затем, поскольку априори неизвестны как n, так и t, следует применить метод «двух иммерсий», т.е. измерить Ψ в двух средах с различными (известными) показателями преломления n1 и n2. Искомый показатель преломления находят из решения системы двух уравнений:
(9)
откуда:
(10)
Здесь же можно определить и геометрическую толщину объекта t:
(11)
Метод «двух иммерсий» требует аккуратности с той точки зрения, что соотношение между искомым показателем преломления и показателем преломления окружающей среды должно быть аналогичным для обеих сред, что при априори неизвестном n, вообще говоря, не выполнено.
Практическая часть.
4.1.Используемое оборудование и материалы:
а) микроскоп поляризационно-интерференционный типа BIOLAR с набором вспомогательного оборудования;
б) набор биологических микрообъектов для исследования: гистологические срезы, клеточные структуры, мазки крови и т.п. (предлагается преподавателем).
4.2. Порядок проведения исследований:
а) подготовить к работе микроскоп и препараты;
б) провести сравнительное качественное исследование микрообъектов дифференциальным и обычным (светополным) методом;
в) определить увеличение микроскопа при проводимых качественных исследованиях;
г) определить разрешение и полезное увеличение микроскопа;
д) произвести калибровку микроскопа для количественного анализа (согласно пп. 3.2.4, 3.2.5);
е) установить вместо окулярной насадки видеонасадку с Web-камерой (см. п.3.3). Получить изображение микрообъекта на экране компьютера и произвести подстройку в рамках приложения Quick Cam. Привести в соответствие характеристики изображения с данными калибровки (п. 4.2, д);
ж) выбрав соответствующие микрообъекты (по согласованию с преподавателем), сохранить необходимое количество изображений в файлах с тем, чтобы вести дальнейшую обработку изображений в рамках соответствующих программ (либо стандартных типа Photoshop, либо оригинальных, на усмотрение самих студентов);
з) определить поперечные размеры, геометрическую толщину и показатель преломления исследуемого объекта.
и) распечатать несколько типичных картин, наблюдаемых на дисплее (при выполнении заданий пп. 4.2, ж,з) и составить таблицу калибровочных и измеренных величин.
к) представить отчет о проделанной работе.
Отчет должен содержать:
· титульный лист с полным названием университета, факультета и кафедры, названием лабораторной работы, ФИО исполнителя и номера группы. Также должен быть указан год выполнения работы;
· цель работы;
· схему экспериментальной установки с описанием назначения каждого элемента схемы;
· результаты исследований в виде таблиц и графиков;
· результаты обработки экспериментальных данных с описанием метода обработки этих данных;
· численные и качественные выводы по результатам исследований. Качественные выводы вида «исследуемая функция в зависимости от изменяемого параметра увеличивается, уменьшается, не зависит, лучше, хуже» не допускаются.