Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

§ Это один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Основой хроматографического разделения является участие компонентов разделяемой смеси в сложной системе Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз.

§ Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна.

§ Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3—5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин).

§ Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно. Так, эксклюзионное разделение бывает осложнено адсорбционными эффектами, адсорбционное — распределительными, и наоборот. При этом чем больше различие веществ в пробе по степени ионизации, основности или кислотности, по молекулярной массе, поляризуемости и другим параметрам, тем больше вероятность проявления другого механизма разделения для таких веществ.

Высокоэффективная жидкостная хроматография является вариантом колоночной хро­матографии. Ее отличие от классической колоночной хроматографии заключается в ис­пользовании сорбентов с размером зерен 10-30 мкм, поверхностно- и объемно-пористых сорбентов с размером зерен 5-10 мкм, нагнетательных насосов и высокочувствительных детекторов. Быстрый массоперенос при высокой эффективности разделения позволяет использовать ВЭЖХ для разделения и определения веществ в молекулярном или ион­ном виде. В ВЭЖХ сорбент в колонке пропитан неподвижной фанзой (НФ). Подвижной фазой (ПФ) является элюент, который подается в колонку насосном. Элюент движется под давлением 200 и более атмосфер. На рисунке представлен общий вид хроматогра­фа «Милихром-4».

Общий вид хроматографа «Милихром-4-ВУФЭ»: 1 - регистратор; 2 - монитор; 3 - клавиатура; 4 - на­сос высокого давления; 5 - поддон; 6 - устройство для ввода пробы автоматическое; 7- колонка аналитическая хроматографическая; 8 - спектрофотометрический детектор на УФ-область спектра; 9 - блок управления микро­процессором; 10- спектрофотометрический детектор на видимую область спектра; 11 - комплект автоматиче­ской системы обработки хроматографической информации.

Разделение основано на различной скорости распределения веществ между непод­вижной и подвижной фазами. Подвижная фаза подбирается так, чтобы обеспечить хоро­шее разделение веществ при сравнительно небольшом времени удерживания.

Если состав подвижной фазы в процессе анализа не меняется, этот режим называют изократическим, если соотношение компонентов меняется - градиентным.

В химико-токсикологическом анализе чаще всего используют вариант обращенно-фазовой хроматографии, когда подвижная фаза более полярна, чем неподвижная фаза. Применяются колонки с привитыми фазами. В качестве подвижных фаз рекомендуются смеси вода - метанол, вода - ацетонитрил или буферные растворы, кислоты, основания. В качестве неподвижной фазы чаще всего применяют гидрофобные вещества, привитые на силикагель (например, «Сепарон-18»).

Колонку в приборе ВЭЖХ изготовляют из стали или стекла диаметром 0,3-0,8 см, дли­ной 6-25 см. Она помещается в термостат, в котором поддерживается определенная тем­пература.

Детектор в ВЭЖХ обычно спектрофотометрический. Он регистрирует оптическую плотность раствора исследуемого вещества при заданной длине волны. Возможно детектирование при нескольких длинах волн.

Идентификация веществ в извлечениях из биологических проб проводится следующим образом:

• сопоставляют время (объем) удерживания определяемого вещества и образца сравнения;

• сравнивают и сопоставляют светопоглощение предполагаемого компонента и образца сравнения при двух или нескольких длинах воли и оценивают их спектраль­ные отношения;

• оценивают совпадение значений времени удерживания определяемого компонент и образца сравнения при добавлении его к экстракту из объекта.

Метод ВЭЖХ нашел широкое применение в настоящее время в практике судебно-химического, клинического анализапри определении и обнаружении в биологических объектах токсических веществ кислотного и основного характера.

Метод ВЭЖХ для общего скрининга не применяется. Это связано с тем, что для каждой группы веществ необходимы специфические условия разделения.

Исследуемые вещества (барбитураты, алкалоиды опия и др.) экстрагируют из подговленного объекта хлороформом, диэтиловым эфиром или смесью хлороформа и п-бутанола. Органический растворитель испаряют в токе теплого воздуха и растворяют в 100 мкл подвижной фазы, а затем анализируют в приборе, используя условия, рекомендуемые для данной группы соединений.