CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Академия

Расхождение между вирусными нагрузками, определенными Roche COBAS AMPLICOR Монитор вируса иммунодефицита человека типа 1 (версия 1.5) Стандартные и сверхчувствительные анализы, вызванные замерзанием плазмы пациента в центрифугированных пробирках для приготовления плазмы марки Becton-Dickinson Vacutainer

Хоссейн Салимния, Эллен С. Мур, Лоуренс Р. Крейн, Роджер Д. Макартур, Мэрилин Р. Фэйрфакс

DOI: 10.1128 / JCM.43.9.4635-4639.2005

• Статья
• Цифры и данные
• Информация и метрики
• PDF

АННОТАЦИЯ

Стандартные и сверхчувствительные анализы на вирусную нагрузку Roche COBAS AMPLICOR вируса иммунодефицита человека типа 1 (версия 1.5) часто давали противоречивые результаты, причем вирусные нагрузки из стандартного анализа превышали таковые из сверхчувствительного анализа более чем на 0,5 log ₁₀примерно для 20% полученных образцов. Мы начали исследования, чтобы определить степень, величину и воспроизводимость несоответствия между анализами, а также выявить и устранить причину этого несоответствия. До этого мы пересматривали нашу стандартную рабочую процедуру, чтобы включить как стандартное, так и сверхчувствительное тестирование всех образцов, представленных для определения вирусной нагрузки. Несоответствующие результаты обычно повторяются при повторном тестировании. Они были наиболее распространены для образцов со сверхчувствительными вирусными нагрузками <1000 и редкими для образцов с вирусными нагрузками> 10000. Часто результаты стандартного анализа превышали результаты ультрачувствительного анализа в 50-100 раз. При более высоких вирусных нагрузках разница между стандартным и сверхчувствительным анализами сохранялась, но процентная разница была меньше и редко вызывала диссонанс. Доля несоответствующих результатов была значительно выше в образцах от педиатрических пациентов, чем в образцах от взрослых. Сверхчувствительные определения вирусной нагрузки в целом согласуются с результатами анализов вирусной нагрузки B-DNA (Bayer). Если плазму переносили из пробирок для приготовления центрифугированной плазмы перед замораживанием, стандартные и сверхчувствительные результаты были согласованы друг с другом и со значениями, определенными для плазмы из пробирок с ЭДТА, покрытых лавандой.

Определение вирусной нагрузки вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) представляет собой стандарт медицинской помощи при первоначальной оценке ВИЧ-инфицированных лиц и при последующем лечении заболевания (4, 11, 13). Ложные высокие вирусные нагрузки могут привести к тому, что пациенты будут без необходимости начинать антиретровирусную терапию. Для пациента, получающего терапию, такие повышенные результаты могут привести к ненужному повторному тестированию, генотипированию ВИЧ или изменениям лекарств. Беременные женщины могут получать ненужные кесарево сечение. Поставщики могут ошибочно сделать вывод о несоблюдении предписанного антиретровирусного режима. Ошибочные выводы могут быть сделаны, если пациент участвует в клиническом испытании. Таким образом, точность и воспроизводимость результатов вирусной нагрузки являются важными факторами. Стандартные и сверхчувствительные анализы Roche, доступные в ручном и автоматическом вариантах (COBAS), являются наиболее распространенными тестами для количественной оценки вирусной нагрузки, а также анализом РНК 3.0 (B-DNA) вируса иммунодефицита человека Байера типа 1 (ВИЧ-1) (B-DNA) (Тарритаун, Нью-Йорк) также широко используется. 2, 3, 5, 6), хотя при очень низких вирусных нагрузках версия 1.5 является более чувствительной (2, 9).

Наша лаборатория предложила как (COBAS) стандартные, так и сверхчувствительные анализы (версия 1.5) и выполнила заказанный тест. Когда стандартные и сверхчувствительные анализы проводили с одним и тем же образцом пациента, сверхчувствительный результат составлял менее 50 копий РНК / мл, тогда как стандартный результат составлял 3000. Это несоответствие повторялось при повторном тестировании образца. Определение вирусной нагрузки ВИЧ-1 для 20 педиатрических больных как стандартными, так и сверхчувствительными методами выявило сходные расхождения в шести результатах, причем стандартные результаты были выше. С июля по декабрь 2004 года мы пересмотрели нашу стандартную рабочую процедуру, чтобы выполнить как стандартные, так и сверхчувствительные анализы на всех образцах плазмы, представленных для определения вирусной нагрузки, и начали исследования, чтобы определить, какой результат был правильным и как устранить проблему.

(Предварительная версия этих данных была неофициально представлена ​​Е.К. Муром на зимнем совещании группы по клиническим испытаниям детской СПИД, Балтимор, штат Мэриленд, 1–4 декабря 2004 года. Некоторая информация была также предоставлена ​​Becton-Dickinson, чтобы позволить им предупредить других клиентов на несоответствие и методы, которые мы разработали, чтобы избежать этого.)

МАТЕРИАЛЫИ МЕТОДЫ

Пациенты. Образцы пациентов, использованные в исследовании, были переданы в университетские лаборатории Детройтского медицинского центра (DMC) для тестирования на вирусную нагрузку в период с июля по декабрь 2004 года. Восемьдесят процентов пациентов были взяты из клиники взрослых DMC (1600 пациентов) или педиатрической клиники (около 90 пациентов). Остальные образцы были предоставлены врачами-инфекционистами или получены от пациентов в наших больницах или в клинике высокого риска по беременности. Это исследование было одобрено Комитетом по правам человека при государственном университете Уэйна.

Сбор и транспортировка образцов. За исключением случаев, описанных для отдельных экспериментов, кровь собирали в пробирки для приготовления плазмы (PPT) с помощью стандартной венепункции и выдерживали при комнатной температуре до центрифугирования при 1100 × g в течение 20 минут в течение 4 часов после сбора. Затем PPT замораживали при -20 ° C до дня испытаний, когда его размораживали при комнатной температуре. PPT представляет собой вакуумную пластиковую трубку для сбора венозной крови. Содержит сушеный К ₂ЭДТА как антикоагулянт. Он также содержит запатентованный гелевый материал, который во время центрифугирования позволяет клеточным элементам проходить сквозь них и образует барьер между плазмой и клетками. Эта технология позволяет транспортировать ППТ без декантации бесклеточной плазмы. Пробирка предназначена для подготовки плазмы для методов молекулярной диагностики, таких как ПЦР. Публикации Roche и Becton-Dickinson (7, 8) поддерживают замораживание PPT для транспортировки и хранения образцов, предназначенных для определения вирусной нагрузки. Эти методы обработки были утверждены как для стандартных, так и для сверхчувствительных анализов в нашей лаборатории в 2000 году (см. Обсуждение).

Тестирование на вирусную нагрузку. Стандартные и сверхчувствительные анализы Roche COBAS AMPLICOR HIV-1 Monitor (версия 1.5) проводились в соответствии с инструкциями на вкладыше в упаковку. Стандартные и сверхчувствительные анализы выполняются с использованием одного и того же набора, но отличаются по пробоподготовке. Стандартный анализ начинается с необработанной плазмы, которая лизируется, экстрагируется, осаждается и снова растворяется. Образец, полученный из 25 мкл плазмы, используется в анализе. Для сверхчувствительного анализа плазму ультрацентрифугируют для осаждения вируса. Надосадочную плазму выбрасывают, а вирусный осадок лизируют, экстрагируют, осаждают и снова растворяют. Анализируется образец, приготовленный из 250 мкл исходной плазмы. Стандартный анализ имеет линейный диапазон от 400 до 750 000 копий РНК / мл, в то время как сверхчувствительный анализ является линейным от 50 до 100 000 копий РНК / мл. Стандартный и сверхчувствительный анализы способны обнаруживать вирус ниже 400 и 50 копий генома на мл соответственно, но результаты являются нелинейными. Присутствующее количество сообщается как <400 или <50, с обозначением (D) или (ND), добавленным для указания, были ли обнаружены вирусные нуклеиновые кислоты или нет, соответственно. Данные представлены на рис. 1 были преобразованы в логарифм 10 оснований (log ₁₀ копий РНК ВИЧ-1 / мл).

• Открыть в новой вкладке
• Скачать powerpoint

РИСУНОК. 1.

Сравнение log ₁₀ -трансформированных стандартных и сверхчувствительных вирусных нагрузок ВИЧ-1. Стандартные (STD) и сверхчувствительные (ULTRA) результаты 145 образцов от 96 педиатрических пациентов (•) и 669 образцов от 572 взрослых пациентов (○) нанесены друг на друга. Сплошная диагональная линия - это линия единства. Согласованные результаты лежат в этой строке или в пределах 0,5 log ₁₀ от нее. Пунктирные вертикальные линии на 1,70 (журнал ₁₀ из 50) и 5 ​​(журнал ₁₀ из 100 000) показывают пределы линейного диапазона сверхчувствительного анализа, а пунктирные горизонтальные линии на 2,60 (журнал ₁₀ из 400) и 5,88 (журнал ₁₀ 750 000) показывают пределы линейного диапазона стандартного анализа. Сплошная вертикальная линия пересекаетось х на 2,60 и очерчивает сверхчувствительные результаты, которые определены в соответствии со стандартными результатами <400. Другие внутренние линии - это линии удобства; числа в полях, которые они создают, указывают количество результатов в этих областях графика. Звездочки и соседние числа указывают образцы выше или ниже пределов линейности обоих анализов.

Определение противоречивых результатов. Несоответствующие результаты были произвольно определены как те, в которых вирусные нагрузки, определяемые стандартным и сверхчувствительным анализами, различались более чем на 0,5 log ₁₀ или примерно в 3,2 раза, хотя фактическая разница обычно была больше. Мы выбрали это число частично потому, что оно представляет собой разницу, которая, по мнению большинства врачей, является клинически значимой (10). При больших числах копий вариация анализа составляет приблизительно 0,2 log ₁₀ (1, 10). Другие авторы показали, что вариация анализа больше на нижних границах линейных диапазонов (6). Различия между нижними пределами диапазонов количественного определения стандартного и сверхчувствительного анализов вносят неизбежные аномалии в оценку диссонанса. Образец со стандартным результатом 400 и сверхчувствительным результатом <50 является несоответствующим (минимальная разница в восемь раз). Для образца со стандартным результатом <400 и сверхчувствительным результатом <50 соответствие не может быть исключено. Разница в пределах обнаружения может привести к неизбежной недооценке разногласий.

Статистический анализ. Данные были проанализированы с использованием SPSS для Windows v. 11.0 (SPSS, Inc., Чикаго, Иллинойс). Точные тесты Фишера использовались для сравнения показателей несоответствия в образцах от детей с показателями в образцах от взрослых для каждого сверхчувствительного диапазона и для комбинированных диапазонов.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Сравнение сверхчувствительных и стандартных вирусных нагрузок. Результаты вирусной нагрузки, полученные в результате как стандартных, так и сверхчувствительных анализов, были доступны для 1265 образцов (включая 814, представленные на рис. 1). Из них 230 (18,2%) были несогласными. Двести восемнадцать дискордантных образцов были отправлены в нашу референс-лабораторию для повторного тестирования, и для 179 образцов были получены как стандартные, так и сверхчувствительные результаты. Сто одиннадцать экземпляров (62,0%) остались несогласованными, в то время как 68 (38,0%) стали согласованными из-за снижения стандартных результатов. Количество дискордантных образцов за один прогон (22 экземпляра) варьировалось от 0 до 13.

На рисунке 1 показан график log ₁₀ -трансформированных стандартных и сверхчувствительных результатов от последовательных образцов взрослых и педиатрических пациентов в течение первых 3 месяцев исследования. Эти образцы включены в 1265, обсужденных выше. Сто сорок пять образцов были включены от 96 ВИЧ-инфицированных педиатрических пациентов (включены только первые два образца / пациент), в возрасте от 3 месяцев до 17 лет, включая 38 женщин. Общий уровень разногласий составил 49,0%; для 135 образцов со сверхчувствительной вирусной нагрузкой менее 10000 копий РНК / мл она составила 51,9%. Ни у одного педиатрического образца не было сверхчувствительной вирусной нагрузки, превышающей 100000 копий РНК / мл. Рисунок 1 также показаны 669 результатов от 572 взрослых пациентов (у пяти пациентов по три образца в каждом), в возрасте от 18 до 77, включая 198 женщин. Общий уровень несоответствия составлял 20,1%, а показатель среди образцов с сверхчувствительной вирусной нагрузкой ≤10 000 копий РНК / мл составлял 25,3%. Пятьдесят семь взрослых образцов (9%) превысили 100 000 копий РНК / мл. Даже в согласованных образцах, где разница между стандартной и сверхчувствительной вирусной нагрузкой составляла <0,5 log, результат вирусной нагрузки, определенный стандартным анализом, как правило, был выше.

Процент образцов с противоречивыми результатами был выше у детей, чем у взрослых. Чтобы определить, были ли различия в процентном отношении дискордантных образцов значимыми для детей и взрослых, данные на рис. 1 были стратифицированы по сверхчувствительной вирусной нагрузке и показаны в таблице 1., Разница в пропорции несоответствующих образцов у детей и у взрослых значительна для всех образцов и для образцов с вирусной нагрузкой <1000, как стратифицированных, так и агрегированных, как показано в таблице. Для вирусных нагрузок от 1000 до 9500 доля дискордантных образцов выше у детей (22,2%), чем у взрослых (11,1%); однако в этом диапазоне так мало педиатрических пациентов с вирусными нагрузками, что у нас нет достаточной силы, чтобы продемонстрировать, что показатели диссонанса у детей и у взрослых значительно различаются. Причины различий в показателях разногласий между детьми и взрослыми выясняются.

• Просмотреть встроенный
• Посмотреть всплывающее окно

ТАБЛИЦА 1.

Разница в процентах несоответствующих определений вирусной нагрузки ВИЧ от детей по сравнению со взрослыми, стратифицированная по результатам сверхчувствительного анализа

B-ДНК результаты. Когда впервые была обнаружена проблема с противоречивыми результатами, мы не знали, были ли правильные стандартные или сверхчувствительные результаты (или ни те, ни другие). Пятьдесят шесть дискордантных образцов с достаточной остаточной плазмой были отправлены в референс-лабораторию для определения вирусной нагрузки методом B-ДНК. Из них 49 соответствовали сверхчувствительным результатам (с использованием тех же 0,5 log ₁₀определение применяется для сравнения стандартных и сверхчувствительных результатов). Из семи (12,5%) образцов с несоответствием результатов сверхчувствительной и B-ДНК только три сверхчувствительных результата превысили результаты B-ДНК более чем в пять раз. Никакая вирусная нагрузка B-ДНК не была выше соответствующего ультрачувствительного результата. Таким образом, ни один из результатов B-ДНК не мог бы соответствовать стандартному результату для того же образца. Эта информация говорит о том, что результаты сверхчувствительного анализа в целом надежны (данные не показаны). Дополнительные результаты B-ДНК приведены в таблице 2.

• Просмотреть встроенный
• Посмотреть всплывающее окно

ТАБЛИЦА 2.

Влияние способа получения плазмы на ВИЧ-1 вирусной нагрузки а

Влияние обработки PPT на результаты вирусной нагрузки. Несколько факторов заставили нас подозревать, что замораживание PPT может привести к противоречивым результатам. Среди них были почти одновременные сообщения о том, что PPT не может быть использован для определенных анализов на гепатит, предложение от Шерил Дженнингс из Медицинского центра Rush и Лаборатории обеспечения качества вирусов, а также информация от Roche, что они могут воспроизвести наши противоречивые результаты с нашими образцами, но не с теми из сотрудничающей лаборатории. Чтобы проверить нашу гипотезу, мы взяли два образца крови каждого из 13 пациентов для тестирования на вирусную нагрузку: один образец для тестирования с помощью пробирки с ЭДТА и один для тестирования с помощью РРТ. В течение 2 часов после отбора образец ЭДТА центрифугировали в течение 20 минут при 1100 × g., Плазму замораживали в двух аликвотах, одну из которых отправляли в контрольную лабораторию для тестирования B-ДНК. ППТ центрифугировали в соответствии с нашим обычным протоколом. Плазму (850 мкл) удаляли и замораживали в транспортной пробирке; остаток был заморожен на месте в PPT. В день испытаний каждый из трех образцов оттаивали при комнатной температуре и тестировали с помощью стандартных и сверхчувствительных анализов. Результаты показаны в таблице 2., Столбцы 2-4 показывают результаты, полученные с плазмой из пробирки с ЭДТА, покрытой лавандой, включая результаты анализа B-ДНК. Столбцы 5 и 6 показывают результаты для аликвоты плазмы, замороженной в пробирке для переноса после удаления из центрифугированного РРТ. Результаты, полученные из плазмы PPT, замороженной в пробирке с аликвотами, согласуются друг с другом, с результатами B-ДНК и результатами EDTA с лавандовым верхом. Двенадцать из 13 образцов показали вирусные нагрузки ниже линейного диапазона всех анализов. Столбцы 7 и 8 показывают стандартные и сверхчувствительные результаты, полученные из плазмы, замороженной in situ в PPT. Восемь из 13 вирусных нагрузок, определенных из плазмы, замороженной в PPT, были дискордантными (обозначены жирным шрифтом). Для семи из этих результатов стандартная вирусная нагрузка увеличилась с <400 (не обнаружено) до 450–3500 копий РНК / мл. К тому же, три образца со сверхчувствительными результатами ниже линейного диапазона в первых двух условиях испытаний были подняты до линейного диапазона (65, 80 и 600 копий РНК / мл) после замораживания на месте. Образец № 13 имели результаты 600 и 5500 копий РНК / мл в сверхчувствительном и стандартном анализах, соответственно, когда анализы проводили на плазме, замороженной in situ; другие анализы, проведенные с этим образцом, не выявили вирусных РНК. Замораживание плазмы пациента in situ при PPT может вызвать повышение как стандартных, так и сверхчувствительных вирусных нагрузок, определенных для этой плазмы. Увеличение вирусных нагрузок, вызванных замораживанием плазмы при PPT, является более многочисленным и более значительным в стандартном анализе, но изменение сверхчувствительных результатов также может быть клинически значимым.

ОБСУЖДЕНИЕ

Замораживание образцов плазмы в PPT, в котором они собраны, повышает артефакты результатов стандартного анализа вирусной нагрузки, но оказывает меньшее влияние на сверхчувствительные результаты. При низких вирусных нагрузках стандартные результаты могут превышать сверхчувствительные результаты в 100 и более раз. В целом, около 18% образцов, полученных в ходе этого исследования, были несоответствующими, а образцы от детей имели значительно более высокий уровень несоответствующих результатов, чем образцы от взрослых. Мы не знаем, почему только некоторые образцы были несоответствующими или почему педиатрические пациенты значительно отличались от взрослых пациентов по пропорции несоответствующих образцов. Эти вопросы находятся в стадии расследования.

Независимо от того, какие неизвестные факторы влияют на несоответствующие результаты, несоответствия могут быть устранены, если образцы плазмы, собранные в PPT, переносятся во вторую пробирку после центрифугирования, но до замораживания. Мы предполагаем, что замораживание PPT высвобождает не содержащий частиц генетический материал ВИЧ-1 из клеток в или ниже геля-разделителя в вышележащую плазму. Поскольку в анализе вирусной нагрузки используется технология ПЦР с обратной транскриптазой, он может амплифицировать любую вирус-специфическую матрицу, как ДНК, так и РНК, которая может присутствовать. Недавнее исследование, проведенное Лабораторией обеспечения качества вирусов (NO1-AI-85354), показало, что одна копия ВИЧ-1-специфической провирусной ДНК может увеличить обнаруженную вирусную нагрузку на 100-200 копий РНК (Cheryl Jennings [Rush Medical Center], личное общение).

Для стандартного анализа нуклеиновые кислоты извлекаются непосредственно из образцов плазмы, поэтому любой загрязняющий генетический материал будет амплифицирован. Для сверхчувствительного анализа вирионы осаждаются из плазмы до экстракции нуклеиновой кислоты, по-видимому, оставляя загрязняющий материал в надосадочной жидкости, которая выбрасывается. Если бы количество генетического материала ВИЧ, выделившегося в плазму, было особенно большим, вирусная нагрузка, определяемая с помощью сверхчувствительного анализа, могла бы быть ложно увеличена за счет свободного генетического материала ВИЧ, оставшегося в небольшом количестве плазмы, загрязняющей вирусный осадок. Эта гипотеза может объяснить более высокую чувствительность к вирусной нагрузке, показанную в таблице 2. столбец 7 (замороженный в PPT) по сравнению с столбцом 5 (замороженный в транспортной пробирке) и результаты B-DNA в столбце 4. Это также может объяснить, почему 12,5% результатов B-DNA, полученных для дискордантных образцов, также были противоречит сверхчувствительным результатам. Таким образом, замораживание плазмы в PPT неприемлемо, даже если планируется сверхчувствительный анализ вирусной нагрузки ВИЧ-1. Другие результаты, не представленные здесь, предполагают, что если образцы в PPT заметно задерживаются при транспортировке или иным образом неправильно обрабатываются, результаты стандартного анализа аналогичным образом скомпрометированы по сравнению с результатами сверхчувствительного анализа. С согласия наших врачей мы прекратили стандартный анализ и предлагаем только сверхчувствительный анализ.

Одна опубликованная статья (12), один недавний плакат (Р. Мерфи, Б. Берзиньш, А. Лик, М. Тилль, В. Стосор, Дж. Стэнтон и Ф. Палелла, 12-я конференция по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, Бостон, Mass., № 738, 22-25 февраля 2005 г.), а также в отдельных отчетах указывается, что другие отмечали несоответствие между результатами, полученными в EDTA и PPT, но не определяли причину. В нашей лаборатории были некоторые предварительные указания на то, что определения вирусной нагрузки были неточными: неспособность амплифицировать вирусную РНК в анализе генотипирования ВИЧ иногда возникала, несмотря на обнаруженные вирусные нагрузки в диапазоне от 1000 до 5000 копий / мл. Поскольку мы изменили наш протокол обработки образцов для определения вирусной нагрузки, эти сбои генотипирования больше не происходят.

Предыдущие документы, показывающие, что замораживание PPT не влияло на вирусные нагрузки (7, 8), делали PPT предпочтительным методом сбора для многих лабораторий. Поскольку ППТ стал доступен до начала высокоактивной антиретровирусной терапии, большинство образцов, использованных в оригинальных валидациях (7, 8), а также в наших собственных, имели вирусную нагрузку, превышающую 10000 копий генома на мл. Числовая разница между диссонирующими стандартными и сверхчувствительными вирусными нагрузками обычно варьировала от 350 до 10000 копий РНК / мл. Только когда высокоэффективная антиретровирусная терапия существенно снижала вирусную нагрузку, расхождение в несколько сотен или даже тысяч копий РНК / мл становилось значимым.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Мы благодарим технологов Лаборатории молекулярной микробиологии Лаборатории университета DMC за их терпение, понимание и поддержку в течение месяцев, необходимых для проведения повторного тестирования, пока мы не устранили причину несоответствующих результатов. Мы благодарим Майкла Крюгера за проведение статистического анализа.

Компания Roche Molecular Diagnostics оплатила все повторные испытания без ограничений по типу или месту проведения испытаний.

Сноски

• Получено 11 марта 2005 г.
• Возвращено для модификации 25 апреля 2005 г.
• Принято 25 мая 2005 г.

• Американское общество по микробиологии

ССЫЛКИ

1. ↵

Brambilla, D., PS Reichelderfer, JW Bremer, DE Shapiro, RC Hershow, DA Katzenstein, SM Hammer, B. Jackson, AC Collier, RS Sperling, MG Fowler, RW Coombs, et al. 1999. Вклад вариации анализа и биологической вариации в общую вариабельность измерений РНК ВИЧ-1 в плазме. СПИД 13: 2269 -2279.

CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Академия

1. ↵

Brambilla, DJ, C. Дженнингс, Р. Морак, С. Грейнджер и Дж. В. Бремер. 2004. Сравнение чувствительности сверхчувствительных наборов Roche AMPLICOR HIV-1 MONITOR версии 1.5 и версии 1.0 при низких концентрациях РНК вируса иммунодефицита человека. J. Clin. Microbiol. 42: 2819 -2820.