В рамках национального проекта «Здоровье» в августе 2006 года в лабораторию поступил комплект оборудования:
1. Полуавтоматический биохимический анализатор «Clima MC-15» (Испания);
2. Автоматический анализатор глюкозы и лактата «Super GL Ambulance» (Германия);
3. Автоматический гематологический анализатор «Advia 60» (Германия);
4. Анализатор мочи «Clinitek Status» (Германия);
5. Набор приборов для проведения иммуноферментного анализа «Bio Rad» (США-Франция).
Дополнительное оборудование:
- Три лабораторных стола;
- Термостат ТС – 1/80 СПУ;
- Центрифуга «Элекон» - 2 шт.;
- Дистиллятор «ДЭ-25»;
- Холодильник «Paracels».
В лаборатории проведен косметический ремонт, заменены лапы, улучшено освещение, смонтированы евророзетки, установлены специальные лабораторные столы.
В январе 2007 года проводилась работа по возрождению биохимических исследований в поликлинике. Приобретались необходимые реактивы, лабораторная посуда, автоматические пипетки, осваивалось новое оборудование.
1. Полуавтоматический биохимический анализатор «Clima MC-15» (Испания).
Предназначен для проведения биохимических и иммунотурбидиметрических исследований.
Методы измерений:
- абсорбция,
- конечная точка,
- кинетика,
- фиксированное время,
- дифференциальный,
- мультистандартный.
Позволяет измерять 30 анализов в минуту по конечной точке и 30 кинетических анализов в течение 3-х минут при минимальном объеме реактива – 0,5 мл.
В анализаторе используются 15-секционные мультикюветы. При проведении анализов по «конечной точке» мультикювета с образцами и реактивами помещается в расположенный на панели анализатора «встряхиватель». Образцы и реактивы перемешиваются, реакция всех образцов начинается одновременно, затем, мультикювета помещается в термостатируемый блок, одновременно на борту анализатора можно инкубировать до 60 проб (4 мультикюветы). После инкубации мультикювету помещают в измерительный блок и в течение нескольких секунд проводят измерение всех 15 образцов. Сначала у меня вызвало опасение интенсивное «встряхивание» образцов, но дальнейшее проведение внутрилабораторного контроля качества и участие в ФСВОК показало, что опасения были напрасными.
С помощью анализатора «Clima MC-15» можно проводить одновременно измерение 15 проб по одному параметру (режим «batch»), измерение разных проб по различным параметрам (режим «random») или измерение одной пробы по 15 параметрам (режим «profile»). Последний чрезвычайно удобен для работы в отделениях реанимации и лабораториях экспресс-диагностики, мы же успешно применяем первые два.
Освоение «Clima» для меня не представляло никакой сложности, т.к. я имею опыт работы на автоматических анализаторах («Cobas E Mira» и «Flexor»). Радует, что с установкой анализатора появилась возможность использования кинетических методов для определения активности ферментов, таких как Алт, Аст, креатинфосфокиназы, лактатдегидрогеназы, возможность расширения меню новых методик (γ-глутаминтрансферазы, КК-МВ). Аппарат позволяет запрограммировать до 60 методик.
Автоматически происходит калибровка системы, распечатка результатов, возможны различные варианты заказа проб в зависимости от требования оператора. Пробы, выходящие за рамки линейности разводятся, результат затем умножается на коэффициент разведения.
Преимущества анализатора бесспорны:
1) Экономное расходование реагентов. Если при работе на ФЭКе требуется 2,5 – 3,0 мл реактива, то при выполнении исследований на анализаторе – 0,5 мл. Экономия практически в 5 раз!
2) Использование небольшого количества сыворотки (7 – 50 мкл).
3) Достаточная производительность.
4) Высокая скорость выполнения анализа.
5) Достижение правильности и воспроизводимости, что определяет качество исследований и позволяет клиницисту эффективно проводить терапию.
6) Гибкость в работе. Обеспечивается возможность выполнения разных режимов определения: по конечной точке, двух – и многоточечной кинетике.
7) «Открытость» системы. Используются наборы только заводского изготовления.
После освоения анализатора первоочередной задачей стало «перевести» большинство «ручных» методик в автоматизированный режим. Для правильной адаптации методик мною были точно рассчитаны соотношение реагента и исследуемого материала, временные интервалы реакции, запрограммированы необходимые значения стандартов, референтные пределы, время и тип реакции, длины волн, в диапазоне которых ведется измерение. Все это я проводила, руководствуясь методичкой к набору.
К анализатору «Clima MC-15» был поставлен стартовый набор реактивов и контрольных материалов, которые, к сожалению, быстро закончились, были представлены сборники адаптаций к наборам, большинство из которых не были «обкатаны», поэтому практически все методики приходилось адаптировать самостоятельно. Для этого я использовала наборы различных фирм: «Human», «Biocon» (Германия), «Витал» (Россия), «ДДС» (Россия), «Диасис» (Германия), «Вектор-Бест», «Абрис» (Россия). Конечно «немецкое» качество сыграло свою роль, до сегодняшнего дня мы стараемся пользоваться наборами «Human» и «Biocon» производства Германии.
Калибровка системы осуществляется автоматически, но режим устанавливается оператором. Все данные о калибровке закладываются в память компьютера, в процессе программирования методики. Мы стараемся использовать «мультикалибраторы», основанные на стандартной сыворотке крови, но в последнее время некоторые фирмы, с реактивами которых мы работаем, рекомендуют калибраторы, входящие в набор. Действительно, при использовании «родных» стандартов качество калибровки улучшается, несмотря на главный недостаток водных стандартов – нестабильность.
Благодаря национальному проекту «Здоровье» лаборатория встала на достаточно высокий уровень технического оснащения, выполняется большой перечень биохимических методик, все время вводятся новые виды исследований, поэтому повышается роль такого важного показателя качества, как воспроизводимость результатов, т.е. степень совпадения результатов при повторном измерении одной и той же пробы.
Основными приказами, которыми мы руководствуемся (№ 45, № 220), содержат количественные показатели воспроизводимости и правильности результатов. Воспроизводимсоть выражается коэффициентом вариации – СV, правильность - показателем смещения – B. В приказе № 45 содержатся предельнодопустимые значения (ПДЗ) для всех параметров, определяемых в лаборатории. Поэтому, прежде чем запустить методику в «общий поток» мною были определены внутрисерийные коэффициенты вариации (CV вс) для всех без исключения методик, адаптированных на «Clima», т.е. я делала по 10 измерений в одной серии каждого вводимого показателя. Только при соответствии C вс предельно допустимым значениям (ПДЗ), я имела право говорить, что методика внедрена в работу. В таблице № 2 представлено проведение некоторых установочных серий.
Установочные серии:
Таблица №2
| Биохимический показатель | CV 10 (%) | CV 10 (%) допустимый по приказу № 45 |
| 1.Мочевина | 3,9 | 5,0 |
| 2.Алт | 6,71 | 9,0 |
| 3.Аст | 5,3 | 6,0 |
| 4.Мочевая кислота | 0,4 | 4,0 |
| 5.Белок общий | 1,9 | 4,0 |
2. Автоматический анализатор глюкозы и лактата «Super GL Ambulance» (Германия).
Анализатор предназначен для одновременного определения глюкозы и лактата в цельной венозной и капиллярной крови, сыворотке, плазме. Производительность – 100 анализов в час. Принцип измерения – энзиматический амперометрический с использованием сенсорной технологии. Прибор имеет автоматическую калибровку, возможна и «принудительная» калибровка, ротор на 9 позиций (8 для образцов и 1 для калибратора). Данные анализа и сообщения выводятся на дисплей и внешний принтер. Имеется программа контроля качества. Диапазон измерения 0,6 – 50,0 ммоль/л для глюкозы и 0,5 – 30,0 ммоль/л для лактата. Объем пробы всего 20 мкл. Трудностей в освоении прибора не было никаких, т.к. ранее приходилось работать на анализаторе «Super GL Ambulance». Наборы к анализатору снабжены контрольными растворами (концентрации: 12,0; 30,0; 4,0 ммоль/л), позволяющие отслеживать работу прибора. Обслуживание анализатора также не представляет сложностей и заключается в своевременной (1раз в 2 месяца) смене сенсора, который заменяется в течение 10 секунд.
За период работы на аппарате мною отмечены некоторые особенности. Ежедневно нам приходилось делать серию проб 40-50. После 24 проб прибор автоматически калибруется, примерно через 38-40 проб на табло появляется сообщение о «сильном дрейфе» и «нестабильных результатах». Перевожу прибор на некоторое время в «спящий режим», затем он снова начинает стабильно работать.
Определение лактата в условиях поликлиники нецелесообразно, т.к. большая востребованность этого исследования в стационарах, лабораториях ИТАРа.
3. Автоматический гематологический анализатор «Advia 60» (Германия).
Метод измерения импедансный. Хорошо проработанный способ, с доведенными до совершенства программным обеспечением детектирования и распознавания клеток, давно зарекомендовал себя как один из самых надежных и неприхотливых методов подсчета клеток крови. Производительность – 60 проб в час, объем пробы – 10 мкл. Определяются 18 параметров крови, используется интегрированный реагентный блок («Timepacbox»), содержащий все необходимые реагенты для выполнения анализов.
«Advia 60» прост и удобен в работе:
- автоматическая промывка с последующей продувкой иглы экономит время оператора, позволяет избежать ошибок, связанных с загрязнением рабочих каналов,
- высокая точность и воспроизводимость результатов,
- троекратный подсчет клеток,
- повышенная безопасность оператора (гнездо для пробирки с кровью защищено крышкой, наличие прокалывающего устройства позволяет работать с пробирками закрытыми крышками, резервуар для отходов входит в состав реагентного картриджа). Освоение анализатора проходило самостоятельно (по техническому руководству), на каждом этапе работы могу оказать помощь работающему на аппарате лаборанту. Недостатком данного прибора, по моему мнению, является высоко расположенное табло и неудобный внешний принтер.
4. Анализатор мочи «Clinitek Status» (Германия).
Прибор предназначен для считывания показаний с тест-полосок. Удобен в использовании, имеет встроенный принтер, дисплей, компьютерный интерфейс и память. Определяются 10 параметров, не требует специальной подготовки и калибровки. Особенность аппарата, выявленная во время работы: после примерно 80-100 проб – нестабильные результаты, аппарату требуется «отдых».
5. Набор приборов для проведения иммуноферментного анализа «Bio Rad» (США-Франция).
Использование в качестве реакционной кюветы стандартного 96-луночного планшета позволило создать комплекс оборудования для автоматизации ИФА-лаборатории, на котором можно проводить весь спектр тестов в микропланшетном формате от различных российских и зарубежных производителей. Этот комплекс включает в себя автоматические дозаторы, специальный инкубатор, промывающее устройство и фотометр для микропланшет («вошер» и «ридер»).
Для достижения высокого качества измерений одним из основных требований является строгое следование инструкции: точность дозируемых объемов, поддержание температуры, процедуры измерения оптической плотности.
Важной характеристикой отдела ИФА является воспроизводимость условий реакции в лунках микропланшета: вариабильность дозируемых объемов, температуры инкубации, условий промывки и измерения оптической плотности между лунками должна быть минимальной.
Всю свою практическую деятельность я посвятила работе в биохимическом отделе, поэтому работа в отделе ИФА началась для меня с изучения специальной литературы, консультаций с практикующими врачами-лаборантами, работающими в иммунологических лабораториях и отделах. Мною был самостоятельно освоен весь комплект оборудования, запрограммирован «вошер PW40» на различные типы промывки, что очень важно, т.к. промывка является одной из ключевых процедур аналитического протокола. Запрограммировала все необходимые методики на фотометр для микропланшет. Программа «ридера» меняется мною при переходе от одной методики на методику другого производителя набора.
Помимо оборудования, полученного по национальному проекту, в 2008 году для лаборатории был приобретен полуавтоматический анализатор «Stat Fax 3300», что позволило «разгрузить» «Сlima» и «КФК 3-01» и перевести на новый фотометр ряд методик, например, определение холестерина липопротеидов высокой и низкой плотности, белок, гемоглобин и ряд других, превратив тем самым «Stat Fax» еще и в «дублирующий» прибор на случай ремонтных работ «Clima», но это касается незначительного ремонта (замена фотометрической лампы, ремонт дисплея или принтера), т.к. остановка анализатора «Clima» хотя бы на день чревата катастрофой для всего биохимического отдела в связи с постоянным увеличением потока исследований и с отсутствием так необходимого автоматического анализатора.
6. Используемые методы исследования (основные). Работа лаборатории.
1) Биохимический отдел.
Ни один обмен не протекает в организме изолированно, поэтому, выполняя исследование важно учитывать все биохимические связи. Так углеводный и липидный обмен взаимосвязаны. Пациентам с сахарным диабетом важно исследовать глюкозу, гликированный гемоглобин, также выполнять липидный спектр, те же исследования необходимо проводить пациентам, страдающим сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Потребность в выполнении липидного спектра у амбулаторных больных неуклонно повышается (диаграмма № 1). Это помимо объективных факторов (возраст, основное и сопутствующие заболевания), связано также с открытием сердечно-сосудистого центра в городе (также в рамках национального проекта) и наша задача отправить пациента из поликлиники на плановое стационарное лечение уже всесторонне обследованным. Мы исследуем общий холестерин, ХС-ЛПВП, ХС-ЛПНП, триглицериды, рассчитываем коэффициент атерогенности (таблица № 3).
Оптимальные значения липидных параметров (новые Европейские рекомендации, версия 2003г.):
Таблица №3
| Липидные параметры | ммоль/л |
| 1. ОХС | < 5,0 |
| 2. ХС-ЛПНП | < 3,0 |
| 3. ХС-ЛПВП |  1,0 (у мужч.); 1,2 (у женщ.)
|
| 4. ТГ | < 1,7 |
Объем выполненных исследований липидного спектра:
Диаграмма № 1
2008г. 2009г. 2010г.
На диаграмме № 2 наглядно представлен рост процента пациентов с выявленными нарушениями липидного спектра и нуждающимися в срочной корректировке липидного обмена. Это связано с вовлечением в обследование все большего числа работающего населения, в связи с диспансеризацией в рамках национального проекта «Здоровье».
Процентное соотношение пациентов с нормальными, пограничными, патологическими показателями липидного обмена относительно общего количества обследованных:
Диаграмма № 2
2008г. 2009г. 2010г.
«1» – норма «2» – пограничное значение «3» – патология
Это важно, т.к. отражает объективную картину состояния здоровья нашего населения. Ранее обследовались пациенты, которые непосредственно обращались с жалобами, большая часть работающего населения получила возможность пройти обследование по мету работы в рамках дополнительной диспансеризации. Порочная практика «не болит, значит здоров» здесь не работает.
Углеводный обмен не имеет такого широкого спектра исследований, более консервативен. Тем не менее, мы ушли от «классической» сахарной кривой к более щадящему способу исследования глюкозы: натощак и через 2 часа после еды.
Наличие в поликлинике дневного стационара и специалиста-кардиолога сделало не менее важным определение кардиоспецифичных ферментов: общей креатинкиназы (КК-МВ), общей лактатдегидрогеназы, аспартатаминотрансферазы. Наличие в отделе полуавтоматического биохимического анализатора «Clima 15-MC» позволяет вести определение этих ферментов в режиме кинетических измерений. Определение активности общей КК необходимо для ранней диагностики острого инфаркта миокарда, но поскольку общая креатинфосфокиназа является маркером повреждения общей и скелетной мускулатуры, то не всегда ее повышение сопряжено с повреждением миокарда. В моей практике нередки случаи увеличения общей КК при механическом повреждении мышц в результате занятий в тренажерном зале, после инъекций. Более информативным является определение сердечной фракции креатинкиназы – КК-МВ, ее превышение 6% от общей КК свидетельствует о развитии острого инфаркта миокарда уже через 4 часа после начала заболевания. Мы в обязательном порядке определяем фракцию МВ при каждом повышенно значении общей КК. Конечно, наряду с КК-МВ необходимо определение миоглобина, тропонина и электрофоретическое выделение ЛДГ-1-фракции, являющейся сердечным изоферментом. Но это больше тесты для стационара, пока мы определяем только общую ЛДГ, а это более поздний маркер ОИМ, нежели общая креатинкиназа.
Терапевты, врачи общей практики, ревматолог стали все чаще обращаться к исследованиям концентрации сывороточного железа, общей железосвязывающей способности, позволяющим поставить диагноз железодефицитной анемии. Около 70% железа, т.е. примерно 4-5г. его общего количества находится в эритроцитах, циркулирующих в крови. Большая часть остального железа запасается в тканях, на этих «складах» железо содержится в белках ферритине и гемосидерине. В обычных физиологических условиях ферритин насыщен железом примерно на 30% от максимальной способности к насыщению. То наибольшее количество железа, которое может присоединить трансферрин до своего полного насыщения, принято обозначать как общую железосвязывающую способность сыворотки крови – ОЖСС. Она складывается из связанной, насыщенно железом части (о которой дает представление показатель «сывороточное железо») и свободной или ненасыщенной железосвязывающей способности (НЖСС). Показатель ОЖСС (TIBC) дает представление об уровне трансферрина в сыворотке.
Мы используем для определения ОЖСС чувствительный метод, где для выявления ионов железа используется хромоген феррозин («Biocon»). Интенсивность окраски пропорциональна содержанию железа и измеряется спектрофотометрически на анализаторе «Clima MC-15». Конечно, в нашей лаборатории проще определять ОЖСС, чем трансферрин, но я думаю, в перспективе развития лаборатории этот показатель будет заменен прямым определением трансферрина с помощью иммунохимических методов исследования. Недостатками данного метода являются: во-первых, требуется не менее 1мл. сыворотки крови, а во-вторых, используемый в методе хлорид железа насыщает не только места связывания трансферрина, а также связывается с альбумином и α- и β-глобулинами, что, естественно, повышает ОЖСС по сравнению с истинной связывающей способностью трансферрина. Хочу отметить, что не все клиницисты понимают, что пациент не должен перед исследованием принимать препараты железа, по крайней мере, в течение 5 суток, в противном случае могут быть получены завышенные результаты.
Подчеркну, что все методики, выполняемые в биохимическом отделе, адаптированы на использование микродоз, что позволяет, в условиях недостаточного финансирования, максимально экономить рабочие реактивы.
Постоянно находясь в «творческом поиске» мы оставляем за собой право менять наборы одних фирм на другие, часто приходят с предложениями менеджеры различных фирм, получая «пробные» наборы, мы обязательно их используем, сравниваем с другими. Так, летом 2010 года участвовали в адаптации на «Clima МС-15» «пробных» наборов «Вектор-Бест» по определению концентрации неорганического фосфора, хлоридов, глюкозы, холестерина. Затем было составлено письменное заключение по качеству реактивов и их удобству в работе. Постоянно внедряются новые методики. В 2009 году в связи с обследованием ветеранов ВОВ мною была адаптирована на «Clima» методика определения γ-глутаминтрансферазы. При переходе от наборов фирмы «Biocon» по определению креатинина на более дешевые «Витал» столкнулись с определенными сложностями при калибровке с мультистандартом «BioCal». Переведя калибровку креатинина на «родной» стандарт все проблемы отпали. Это еще раз доказывает, что водные стандарты той же фирмы хоть и являются нестойкими (срок использования при соблюдении соответствующих методике условий не более недели), но более подходят к данной методике.
Далее в таблице № 4 предлагается перечень биохимических исследований, выполненных в КДЛ. Учитывая, что с 2007 года биохимические и иммуноферментные исследования в лаборатории проводят два сотрудника, с уверенностью могу сказать, что данные показатели являются моим личным вкладом в работу лаборатории.
Перечень биохимических исследований, выполненных в КДЛ:
Анализатор «Clima MC-15» Таблица №4
| Вид исследования | Принцип метода | Фирма-производитель реактивов | 2008г. | 2009г. | 2010г. |
| 1. Алт | кинетический | Diasis, Вектор-Бест | |||
| 2. Аст | кинетический | Diasis, Вектор-Бест | |||
| 3. Мочевина | уреазный | Biocon | |||
| 4. Креатинин | псевдокинетика | Biocon, Витал | |||
| 5. Мочевая кислота | уриказный | Витал, Абрис | |||
| 6. Холестерин общий | холестерал-эстеразный | Витал, Абрис | |||
| 7. Триглицериды | ферментативный | Витал, Абрис | |||
| 8. Кальций общий | Образование комплекса с О-крезолфталеином | Витал | |||
| 9. Железо | метод с феррозином | Biocon | |||
| 10. α-амилаза | кинетический | Витал, Вектор-Бест, Абрис | |||
| 11. Глюкоза | гексокиназный, глюкозооксидазный | Витал, Абрис | |||
| 12. КК | кинетический | Cormay, Diasis | |||
| 13. ЛДГ | кинетический | Diasis | |||
| 14. Хлориды | фотометрический с роданидом ртути | Вектор-Бест, Витал | |||
| 15. Щелочная фосфатаза | кинетический | Human | |||
| 16. Фосфор неорганический | с молибдатом аммония | Витал | |||
| 17. ГГТ | кинетический | Вектор-Бест | - | - |
«Stat Fax 3300»
| 18. ХС-ЛПВП | осаждение с фосфорно-вольфрамовой кислотой | Витал, Абрис | |||
| 19. ХС-ЛПНП | осаждение гепарином | Biocon | |||
| 20. Белок общий | биуретовый | Абрис, Вектор-Бест, Витал |
Фотометр «КФК 3-01»
| 21. Билирубин общий | метод Ендрассика-Грофа | Витал | |||
| 22. Билирубин прямой | метод Ендрассика-Грофа | Витал | |||
| 23. Тимоловая проба | Хуэрго и Поппер (взаимодействие сыворотки с тимолово-вероналовым буфером) | Абрис, Витал | |||
| 24. Серомукоид | выделение серомукоида фофорно-вольфрамовой кислотой |
Исследования, выполняемые методом латекс-агглютинации
| 25. С – реактивный белок | латекс-агглютинация | Абрис | |||
| 26. Ревматоидный фактор | латекс-агглютинация | Абрис | |||
| 27. Анти-стрептолизин - О | латекс-агглютинация | Абрис |
Исследования патологии гемостаза
| 28. Фибриноген | образование сгустка с ионами кальция | - | |||
| 29. ПТИ | Ренам | ||||
| 30. МНО | МИЧ | Ренам |
Как видно из таблицы, объем исследований с каждым годом неуклонно возрастает, что требует немалых сил для их выполнения и приводит к мысли о расширении штата сотрудников, а также о первоочередном приобретении коагулометра для выполнения неполной коагулограммы (в том числе, для пациентов, направляемых на плановое оперативное лечение), а также биохимического автоматического анализатора для малых и средних лабораторий (например «Flexor Junior»).
2) Отдел иммуноферментного анализа.
ИФА требует стандартизации не только аналитического, но и преаналитического этапа – правильного назначения, подготовки пациентов, взятия и долабораторной обработки материала. В тест-системах ИФА используются различные схемы реакционного процесса (непрямой ИФА, «сэндвич», конкурентный метод), что влечет за собой определенные особенности выполнения протокола и представления результата. Несмотря на это, принципы метода и правила выполнения его отдельных этапов остаются неизменными для большинства исследований ИФА.
Отдел ИФА начал свою работу в 2008 году в связи с необходимостью выполнения опухолевых маркеров пациентам, проходящим дополнительную диспансеризацию.
Термин «опухолевые маркеры» охватывает широкий спектр биологических веществ с различными характеристиками, но объединенных связью со злокачественными процессами, что делает возможным их применение в диагностике, скрининге, мониторинге и прогнозе течения заболевания у пациентов со злокачественными опухолями. Хороший ОМ должен быть органоспецифичным, его концентрация должна коррелировать с размерами опухоли, стадией заболевания, распространенностью процесса, прогнозом и эффективностью лечения.
При прохождении дополнительной диспансеризации, женщинам и мужчинам с 45лет с 2010 года (ранее с 40 лет – женщинам и с 45 лет – мужчинам) обязательно кровь исследуется на СА125 и ПСАобщ. соответственно. СА125 является стандартом в обследовании женщин при обнаружении новообразований в малом тазу. СА125 – гликопротеиновый антиген, вырабатываемый клетками серозных злокачественных опухолей яичников и определяемый с помощью специфических моноклопальных антител. Не является строго специфичным, границы нормы колеблются до 35 Ед/мл. Повышенный уровень СА125 выявляется у примерно 80% всех пациенток с эпителиальными опухолями яичников, до 90% среди пациенток с распространенным раком яичников, однако на первой стадии заболевания СА125 повышен только у 50% больных. Необходимо учитывать, что не существует опухолевого маркера со 100% специфичностью по отношению к опухоли (повышение уровня может быть связано с другой опухолью или доброкачественным процессом), а «нормальный» уровень не исключает наличие злокачественного процесса или рецидива. Из-за гетерогенности опухолей часто целесообразно использование нескольких различных маркеров.
Простатаспецифический антиген (ПСА) – гликопротеин, секретируемый клетками эпителия канальцев предстательной железы, у здоровых мужчин не превышает 4 нг/мл. Может быть использован для скрининга, диагностики доброкачественных заболеваний (аденомы) и рака простаты, мониторинга течения, эффективности терапии и раннего выявления рецидивов рака простаты, мониторинга состояния пациентов с гипертрофией простаты, с целью обнаружения ее злокачественного перерождения. Этим объясняется широкое применение данного теста не только в рамках национального проекта, но и специалистом-урологом нашей поликлиники. ПСА хорошо зарекомендовал себя для скрининга рака простаты у мужчин старше 50 лет.
В 2010 году в связи с Приложением № 1 к приказу МЗ РК от 15.12.2009г. №1179 мы провели углубленное диспансерное обследование ветеранов Великой Отечественной Войны, их жен и вдов, приравненных к ветеранам ВОВ. Было обследовано 68 человек, проживающих в районе обслуживания поликлиники № 3. Проведено биохимическое исследование крови, включающее 15 параметров, а также онкомаркеры. Помимо СА 125 и ПСА, методики которых были успешно отработаны и поставлены на «поток», мною были адаптированы еще 3 методики на ОМ: α-фетопротеин (АФП), раковоэмбриональный антиген (РЭА), раковый антиген СА 19-9.
α-фетопротеин (АФП) – гликопротеин, секретируемый эмбриональными клетками печени и желточного мешка. Высокая концентрация его в сыворотке крови мужчин и небеременных женщин почти всегда совпадает с наличием опухоли (гепатоцеллюлярный рак печени, метастатические поражения печени опухолями другого происхождения). У взрослого человека нормальное содержание АФП в сыворотке незначительно и составляет 2-10 нг/мл.
Раковоэмбриональный антиген (РЭА) может быть использован для диагностики и мониторинга течения и эффективности терапии рака толстого кишечника, молочной железы, легких, С-клеточной карциномы щитовидной железы. Верхняя граница нормы у здоровых людей обычно не превышает 3 нг/мл.
Раковый антиген СА 19-9 – эпителиальный гликопротеин, используемый для диагностики, мониторинга течения, оценки эффективности лечения, раннего выявления рецидивов при раке поджелудочной железы, колоректальном раке, раке желудка, аденокарциноме пищевода. Нормальными считаются значения концентрации СА 19-9 до 37 Ед/мл.
Параллельно с определением концентрации опухолевых маркеров велась работа по определению концентрации гормонов щитовидной железы (ТТГ, Т3, Т4).
Тиреотропный гормон (ТТГ), его определение является основным методом для диагностики заболеваний тиреоидного профиля, первым этапом диагностики функции щитовидной железы, позволяющим предположить наличие гипо-, гипер- или эутиреоза.
В случае высоких значений ТТГ необходимо определять уровень св. Т4. Низкие концентрации ТТГ при высоком содержании св. Т3 говорят о гипертиреоидном состоянии.
Базальные значения ТТГ и интерпретация:
Таблица №5
| Концентрация ТТГ (м Ед/л) | Комментарий |
| 1. Ниже 0,1 | При повышенных концентрациях св. Т4. или св. Т3 – гипертиреоз с подавленной регуляцией гипофизарно-тиреоидной системы. |
| 2. 0,1 – 0,4 | Ниже нормы необходимо определение св. Т4. и Т3 |
| 3. 0,4 – 0,5 | Эутиреоидный диапазон. Могут проявляться функциональные нарушения щитовидной железы. |
| 4. 5,0 – 10,0 | Выше нормы. Рекомендуется проведение ТРГ-теста для подтверждения или исключения латентной формы гипотиреоза. Дефекты усвояемости йода, выраженная недостаточность йода, состояние после операции на щитовидной железе. Опухоли гипофиза. |
| 5. Выше 10 | Первичный гипотиреоз, опухоли гипофиза, продуцирующие ТТГ. |
Определение концентрации ТТГ получило широкое распространение в поликлинике, чего не скажешь о св. Т3 и св. Т4. Методики на св.Т3 и св.Т4 были успешно адаптированы мноюй на анализатор ИФА, но небольшая потребность врачей-эндокринологов в назначении данных гормонов вкупе с дорогими тест-системами не позволяли вовремя выдавать результаты анализов (приходилось «замораживать» сыворотки пациентов на длительный период времени, чтобы «накопить» достаточное их количество для использования набора), так что исследования к моменту выполнения теряли свою актуальность. В настоящее время кровь на определение концентрации гармонов св.Т3 и св.Т4 отправляют по договорам в другие медицинские учреждения.
Трехлетний этап моей работы в отделе иммуноферментных исследований представлен в сводной таблице № 6.
Сводная таблица работы отдела ИФА:
Таблица №6
| Вид исследования | Краткая характеристика | Количество исследований за 2008г. | Количество исследований за 2009г. | Количество исследований за 2010г. | Выявленная патология (% от общего числа анализов) |
| 1. ТТГ | Основной гормон для диагностики заболеваний тиреоидного профиля | 12% | |||
| 2. Альфа-фетопротеин (АФП) | Диагностика и мониторинг первичных гепатоцеллюлярных и эмбрионально-клеточных опухолей | - | - | 0% | |
| 3. Опухолевый антиген 125 (СА 125) | Мониторинг рака яичников | 0,9% | |||
| 4. Простата-специфический антиген (ПСА) | Диагностика, скрининг и мониторинг рака простаты | 6,1% | |||
| 5. Опухолевый антиген 19-9 (СА 19-9) | Мониторинг рака поджелудочной железы | - | - | ||
| 6. Раково-эмбриональный антиген (РЭА) | Мониторинг опухолей ЖКТ и других аденокарцином | - | - | 0,1% |
В основе метода ИФА лежит оценка результатов иммунной реакции антигена с антителом. Полученный комплекс определяется следующим образом: в реакционную смесь вводят конъюгат, который включает в себя ферментную метку, а также добавляют специальный хромогенный субстрат. В схемах ИФА объектом исследования могут быть как антигены, так и антитела. Для определения антигенов в качестве последнего может выступать регуляторный белок, гормон, онкомаркер, обладающие иммуногенной активностью. Сегодня наибольшее распространение получил гетерогенный (твердофазный) ИФА в микропланшетном формате. В качестве твердой фазы используется поверхность лунок микропланшета, на которую адсорбированы известные антигены или антитела – это иммуносорбент. В ходе высокоспецифической реакции иммуносорбента с определяемыми в исследуемом образце антителами или антигенами образуются иммунные комплексы, которые оказываются фиксированными на твердой фазе. Субстанции, не участвующие в реакции, удаляются при многократной промывке.
В наборах для ИФА мы в основном пользуемся разновидностью неконкурентного гетерогенного ИФА – «сэндвич»:
1. На поверхности лунок сорбированы антитела. В лунки вносим сыворотку.
2. Исследуемые антигены связываются с антителами, другие компоненты удаляются отмыванием.
3. В лунки вносим конъюгат, представляющий антитела, меченые ферментом. Если в ячейке имеются иммунные комплексы, образовавшиеся на первой стадии, то конъюгат соединяется с определенными антигенами и образует тройной комплекс – «сэндвич».
4. В лунки добавляем субстратно-хромогенный реагент, который под влиянием фермента конъюгата превращается в окрашенный продукт реакции. Количество тестируемых антигенов оценивают по измерению оптической плотности окрашенного продукта реакции.
В ходе освоения иммуноферментного анализа я четко усвоила главное: строгое следование инструкции к набору и использование только «свежих» тест-систем с соблюдением правил их хранения. Если в наборе предложены лиофилизированные стандарты и контрольные сыворотки, точность дозирования максимальна, иначе не избежать увеличения коэффициента вариации. Раскалывание только одноразовым наконечником, причем для каждого вносимого образца – новый! Избегать прикосновения наконечника к стенкам и дну лунки. Температурный режим в кабинете (не ниже 18 °C) и интенсивность встряхивания на шейкере также важны. По личным наблюдениям, повышенный фон и высокая вариабельность результатов могут быть связаны с качеством промывки. Промывающее устройство имело поначалу «наклон», таким образо