ЛАБОРАТОРНО – ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 2.
Подготовка вируссодержащего материала для транспортировки и заражения лабораторных объектов
Цель занятия: ознакомиться с техникой взятия, упаковки и транспортировки, сохранения и подготовки вируссодержащего материала для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и культуры клеток.
Оборудование и материалы: пенициллиновые флаконы с кусочками паренхиматозных органов, залитых раствором Хенкса и замороженных, стерильные фарфоровые ступки с пестиками, стерильный стеклянный песок, стерильные чашки Петри (по две на рабочее место), стерильные центрифужные пробирки (количество их должно соответствовать числу рабочих мест), раствор Хенкса, пенициллин и стрептомицин, МПА, МПБ в пробирках на каждое рабочее место, стерильные пенициллиновые флаконы, стерильные резиновые пробки №14 или 14,5, ножницы, пинцеты, спиртовки, центрифуга, бумажные фильтры, таблицы по теме.
В ходе самостоятельной работы студентов необходимо
1. Подготовить исследуемый материал для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и культур клеток путем обработки антибиотиками.
2. Проверить полученный материал на стерильность путем высева на МПА, МПБ.
Примерный план занятия (2 ч)
1. Контрольные вопросы.
2. Объяснения преподавателя.
3. Демонстрация: а) набора посуды и инструментов;
б) приемов взятия смывов со слизистой оболочки носовой полости, конъюнктивы, прямой кишки у телят и других животных;
в) этикетирования и транспортировки взятого материала.
4. Самостоятельная работа студентов.
5. Подведение итогов занятия.
6. Задание к следующему занятию.
Методические указания
Занятие можно провести следующим образом. Первый час посвятить объяснению и демонстрации приемов взятия материала от животных, находящихся в клинике института. Второй час студенты проводят работу по подготовке материала к исследованию.
На данном занятии ограничиваются только демонстрацией взятия материала от животных, так как весь процесс студенты будут отрабатывать при прохождении учебно-производственной практики.
Вопросы домашнего задания
1. Морфология и химический состав вирусов.
2. Структуравирусов.
3. Функции нуклеиновой кислоты и вирусного белка в онтогенезе вирусов.
4. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.
5. Микроскопический метод исследования.
Краткие теоретические сведения
Вирусологическое исследование сводится к выделению вируса из патматериала, его серологической идентификации и подробному изучению различных свойств (патогенность, антигенность, культивируемость в лабораторных условиях, морфологические признаки).
В каждом случае заболевания с подозрением на вирусную этиологию в первую очередь надо выделить возбудителя из патматериала. В этой связи правильный отбор, упаковка, транспортировка и обработка материала имеют очень большое значение для успешной постановки диагноза на вирусное заболевание.
Материал для исследования. От заболевших, павших или вынужденно убитых животных его отбирают как можно быстрее после появления четких признаков болезни или не позднее 2...3 ч после их клинической смерти или убоя. Это связано с тем, что сразу после заболевания или в первые 1-2 дня болезни значительно ослабевает барьерная роль кишечника, что наряду с повышенной проницаемостью кровеносных сосудов, способствует распространению кишечной микрофлоры
При взятии материала для выделения вируса следует исходить из патогенеза изучаемой инфекции (входные ворота, пути распространения в организме, места репродукции и пути выделения). Так, при респираторных инфекциях для выделения вирусов берут носоглоточные смывы, мазки из носовой полости и глотки, соскобы трахеи и кусочки легкого трупов; при энтеровирусных — кал; при нейротропных — кусочки головного или спинного мозга; при дерматропных инфекциях — свежие поражения кожи и т.п., т.е. отбирают тот материал, в котором предполагается наибольшая концентрация вируса. Материалом для выделения вируса могут служить различные экскреты и секреты, кусочки органов, кровь, лимфа и пр.
При вскрытии трупов животных материал отбирают при строгом соблюдении всех правил асептики и антисептики, чтобы не заразиться самому, не внести посторонних возбудителей в исследуемый материал и не допустить распространения инфекционного начала.
Кровь берут из яремной вены, кончика хвоста или уха, венозного сплетения глаз и т.д.
Для выделения вируса используют цельную дефибринированную, "лаковую" кровь (смесь крови с дистиллированной водой в отношении 1:1), либо отдельные элементы крови (эритроциты, лейкоциты, плазма, сыворотка).
Для обнаружения противовирусных антител кровь берут у одного и того же животного дважды с интервалом в 2...3 недели (для получения парных сывороток в объеме не менее 5,0 мл каждой).
Смывы со слизистой оболочки носовой полости, глаз, с задней стенки глотки, прямой кишки и клоаки у птиц берут стерильными ватными тампонами и погружают их в пенициллиновые флаконы или пробирки, содержащие 3-5 мл соответствующей жидкости. Наиболее часто для этого используют раствор Хенкса или среды для культур клеток (ГЛА, 199, Игла) с антибиотиками (пенициллин, стрептомицин по 500 ЕД и нистатин по 20 ЕД на 1 мл среды) с белковым стабилизатором, например, 0,5%-ным раствором желатина или 0,5...1%-ным раствором альбумина бычьей сыворотки. Присутствие стабилизаторов необходимо для предотвращения быстрой инактивации некоторых вирусов, например, вируса парагриппа.
При взятии материала из носоглотки можно использовать прибор, сконструированный Томасом и Стоком. Он состоит из трубки диаметром 9 мм и длиной 30 см, внутри которой помещается вторая тонкая трубка с нержавеющим стержнем, оканчивающимся нейлоновой щеткой. Прибор вводят глубоко в носовые ходы (хоаны) или в горло через носовой ход, выдвигая щеточку, а затем вновь задвигая ее в трубку перед тем, как вынуть прибор из органа. Щеточку тщательно отмывают от слизи и клеток в 2 мл жидкости (раствор Хенкса).
Слюну отбирают при наличии признаков поражения ротовой полости или слюнных желез. Вытекающую изо рта слюну можно собрать прямо в пробирку. Если ее выделяется мало или она не вытекает, необходимо пропитать слюной стерильный тампон на палочке, а затем поместить в пробирку с небольшим количеством раствора Хенкса и закрыть резиновою пробкой. Для усиления слюноотделения животному можно ввести пилокарпин из расчета 0,02...0,05 г на 1 кг массы.
Мочу отбирают при помощи катетера в стерильную посуду.
Фекалии берут из прямой кишки при помощи шпателя или палочкой и помещают в стерильную пробирку или пенициллиновый флакон.
Везикулярную жидкость собирают шприцем или пастеровской пипеткой в стерильную пробирку.
Стенки афт, корочки с поверхности кожи снимают пинцетом.
Спинномозговую жидкость берут асептически путем обычной пункции.
В качестве патматериала используют кусочки органов объемом несколько см3 и массой 10-20 г, которые:
а) имеют видимые отклонения от нормы по форме, размеру, цвету, консистенции, наличию необычных образований;
б) могут быть поражены и содержать вирус;
в) наиболее часто содержат вирус — печень, селезенка, легкие, головной мозг, лимфатические узлы, почки.
Таблица 1.
Отбор патологического материала для диагностики некоторых вирусных болезней сельскохозяйственных животных
| Болезнь | Носовые выделения | Содержание везикул, пустул, афт | Слюна | Кровь | Фекалии | Кожные поражения | Поражения конъюнктивы | Мозг | Легкие | Печень | Лимфоузлы | Спинномозговая жидкость | Селезенка | Почки | Слизистая оболочка кишечника | Кусочки новообразований | Кусочки бронхов, трахей |
| + | |||||||||||||||||
| Бешенство | + | ||||||||||||||||
| Ящур | + | + | |||||||||||||||
| Везикулярный стоматит | + | + | + | ||||||||||||||
| Болезнь Ауески | + | + | + | + | + | + | |||||||||||
| Ротавирусная инфекция | + | + | |||||||||||||||
| Парвовирусная инфекция | + | + | |||||||||||||||
| Инфекционный ринотрахеит КРС | + | + | + | + | |||||||||||||
| Вирусная диарея КРС | + | + | + | + | + | + | + | + | |||||||||
| Парагрипп КРС | + | + | + | + | + | ||||||||||||
| Аденовирусная инфекция КРС | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | |||||||
| Ринопневмания лошадей | + | + | + | + | |||||||||||||
| Чума свиней | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | ||||||
| Африканская чума свиней | + | + | + | + | + | + | |||||||||||
| Болезнь Тешена | + | + | + | + | |||||||||||||
| Инфекционный гастроэнтерит свиней | + | + | |||||||||||||||
| Грипп свиней | + | + | + | + | |||||||||||||
| Везикулярная болезнь свиней | + | + | |||||||||||||||
| Везикулярная экзантема свиней | + | + | |||||||||||||||
| Контагиозная эктима овец и коз | + | + | + | ||||||||||||||
| Оспа овец | + | + | |||||||||||||||
| Грипп уток | + | + | + | + | + | ||||||||||||
| Инфекционный ларинготрахеит кур | + | + | + | + | |||||||||||||
| Инфекционный бронхит кур | + | + | |||||||||||||||
| Вирусный гепатит утят | + | + | + | ||||||||||||||
| Лейкоз птиц | + | + | + | + | + | + | |||||||||||
| Болезнь Марека | + | + | + | + | + | ||||||||||||
| Ньюкаслская болезнь | + | + | + | + | + | + | + | ||||||||||
| Оспа птиц | + | + | + |
Транспортировка и хранение проб. Взятые пробы необходимо как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедление процессов инактивации вируса. Такие условия обеспечивают низкие температуры. Для этого пробирки (флакончики) с патматериалом, закрытые резиновыми пробками, помещают в термос с охлаждающей смесью.
Структура упаковочного контейнера:
Первичная емкость: емкость, содержащая пробу (пробирка с завинчивающейся пробкой с нетоксичной резиновой прокладкой, обернутой лейкопластырем, или запаянная стеклянная ампула);
Внутренняя упаковка: - поглощающий материал — папиросная бумага или вата в количестве, достаточном для впитывания жидкости в случае утечки;
- пластиковый мешок, заполненный или заклеенный неволокнистым лейкопластырем;
Наружная упаковка: - противоударная прокладка, (скомканная бумага или вата);- твердый водонепроницаемый контейнер;- плотно пригнанная крышка, завинчиваемая или уплотняемая, заклеиваемая лейкопластырем или закрепляемая зажимами.
В качестве охлаждающей смеси используют смесь равных частей сухого льда (твердая углекислота) и этилового спирта, тогда температура минус 71 °С держится несколько дней. Можно использовать смесь, состоящую из трех весовых частей льда или снега и одной весовой части поваренной соли. В последнем случае удается получить температуру минус 15... 20 °С. Вместо замораживания можно использовать химические консерванты, но это менее эффективно. Лучшим из них считается смесь равных объемов стерильного глицерина и 0,85%-ного раствора поваренной соли (изотонический раствор). Обычно эту смесь рекомендуют использовать для консервирования кусочков паренхиматозных органов и тканей.Глицерин — это простейший трехатомный спирт. Он смешивается с большинством компонентов живой клетки. В него быстро диффундирует вода и электролиты, а сам он легко проникает в другие растворы и гели и не переходит в твердое состояние при низких температурах - минус 110 °С.
Растворы глицерина менее пригодны для вируссодержащих жидкостей, особенно в тех случаях, когда этот материал нужно вводить животным, эмбрионам и в культуру клеток в неразведённом виде. Употребление его делает невозможным исследование патологического материала методом иммунофлуоресценции, поэтому одновременно с пробой патматериала необходимо направить мазки-отпечатки, приготовленные и фиксированные на предметном стекле, для исследования на люминесцентном микроскопе.
|
Подготовка вируссодержащего материала. В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают от глицерина, взвешивают или измеряют. Часть берут для вирусологического анализа, оставшуюся — хранят в холодильнике на случай необходимости дополнительных исследований. Затем составляют план исследований присланного материала.
Подготовку вируссодержещего материала для заражения чувствительных объектов осуществляют двумя методами: с помощью обработки антибиотиками или путем стерилизующего фильтрования.
Подготовка органов и тканей. Вирус необходимо высвободить из клеток органов и тканей и перевести в раствор Хенкса. Для этого материал тщательно измельчают ножницами и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Добавлять толченое стекло менее желательно, так как оно обладает щелочными свойствами и может инактивировать часть вирусных частиц. Но и на тонко растертых песчинках или частицах стекла, обладающих большой поверхностью, часть вируса может адсорбироваться и уйти затем в удаляемый осадок. Из растертого материала обычно готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса. Полученную суспензию на растворе Хенкса центрифугируют при 1500...3000 об/мин в течение 15...30 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и освобождают от микрофлоры, либо пропуская через бактериальные фильтры (это делают редко, так как теряется много вируса за счет адсорбции на фильтре), либо обрабатывают антибиотиками широкого спектра действия (пенициллин, стрептомицин, нистатин, тетрациклин, кристалломицин и т.д.). Дозы антибиотиков, применяемых для этой цели, могут колебаться в довольно широких пределах (от 100 до 1...2 тыс. ЕД и более на 1 мл) в зависимости от характера исследуемого материала. Рекомендуют следующие дозы антибиотиков- пенициллина 1000 ЕД, тетрациклина 100 мкг, стрептомицина 500 ЕД, нистатина 30 ЕД на 1 мл. Следует избегать излишне больших доз, так как их избыток при дальнейшем внесении в культуру клеток может вызвать неспецифическую дегенерацию последних. Предпочтительность тех или иных доз антибиотиков и оптимальный режим центрифугирования в каждом конкретном случае указан в инструкции по диагностике соответствующих вирусных болезней.
Экспозиция суспензии с антибиотиками должна быть не менее 30...60 мин при комнатной температуре, затем материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и культур клеток. В случае положительного бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке антибиотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при минус (20... 70) °С.
Подготовка выделении из носа и глаз. Тампоны погруженные в соответствующий раствор, встряхивают 10...15 мин, тщательно отжимают, полученную жидкость центрифугируют 20 мин при 2000...3000 об/мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку и в нее добавляют пенициллин и стрептомицин по 500...1000 ЕД на 1 мл, выдерживают и после бактериологического контроля используют для заражения. Из осадка клеток готовят мазки для РИФ.
Подготовка фекалий. Пробу кала (приблизительно около 1 г) помещают в баночку с бусами, содержащую 10 мл раствора Хенкса. После гомогенизации материала встряхиванием и последующего центрифугирования при 2000...3000 об/мин в течение 30 мин надосадочную жидкость отсасывают, добавляют пенициллин, стрептомицин по 500... 1000 ЕД/мл, нистатин 30 ЕД/мл и тетрациклина 200 мкг/мл. После 30...60 мин контакта производят посев на стерильность, замораживают и хранят при минус (10... 20) °С. В день заражения животных или культуры клеток исследуемый материал оттаивают и повторно центрифугируют для удаления вновь образующегося поле замораживания осадка. Неиспользованный материал хранят в замороженном состоянии до конца исследований. Исследование кала может быть заменено ректальными мазками, обработка которых требует меньше времени, а частота выделения вируса при этом не только не меньше, но иногда выше.
Мочу обрабатывают антибиотиками 500...1000 ЕД/мл и используют для заражения.
При кожных высыпаниях исследуют содержимое папул, пузырьков и пустул, чешуйки и корки. Содержимое папул и пузырьков разводят раствором Хенкса в соотношении 1:5, а корки, чешуйки после растирания суспендируют в солевом растворе 1:5-1:10 и подвергают центрифугированию при 2000...3000 об/мин в течение 10... 15 мин. После обработки пенициллином и стрептомицином (по 200...500 ЕД/мл) материал используют для заражения.
Подготовка крови. Для выделения вируса может быть использована цельная дефибринированная, "лаковая" кровь или кровь с антиксагулянтом. В последнем случае берут 5 мл крови в пробирку с 5-6 каплями гепарина и замораживают. После оттаивания гемолизированную кровь центрифугируют при 2000...3000 об/мин в течение 15 мин, добавляют пенициллин и стрептомицин из расчета 100... 200 ЕД/мл и после проверки на стерильность используют для заражения. Для этих целей пригодна и свернувшаяся кровь. Ее растирают в ступке и добавляют небольшое количество раствора Хенкса (1:1 или 1:2), а далее поступают аналогично.
Для освобождения вируссодержащего материала от микроорганизмов применяют стерилизующее фильтрование. Чаще всего используют асбестовые пластинки, керамические свечи, коллодийные мембраны и стеклянные фильтры. Асбестовые фильтры готовят из прессованного асбеста в виде кружков диаметром35, 140 и 350 мм. Выпускают фильтры марки "Ф" (фильтрующие), задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие частично бактерии, и "СФ" (стерилизующие), задерживающие все виды бактерий, не пропускающие вирусы.
Коллодийные мембраны (ультрафильтры) готовят из нитроклетчатки (коллодия) с точно калиброванными порами. Иногда их называют градоколовыми фильтрами (англ. graduate — калибровать; кол — от слова коллодий). Широкое распространение получили мембранные фильтры. Для фильтрования вирусов используют фильтры с диаметром пор 100-400 нм. В настоящее время мембранные фильтры являются наиболее совершенными.
Керамические свечи представляют собой удлиненной формы полые цилиндры, закрытые в нижней части (свечи Шамберлена, Беркефельда, каолиновые фильтры Санкт-Петербургского керамического НИИ). Их изготовляют из каолина с различной степенью порозности.
Стеклянные фильтры готовят из пористого стекла. В последние годы довольно широкое распространение получили фильтры Шота с пластинкой №5 из сплавленных мельчайших гранул отекла.
Суспензии, содержащие вирус, перед фильтрованием необходимо освободить от грубой взвеси. Для этого их вначале центрифугируют в течение 10...15 мин при 1500...2000 об/мин и фильтруют через бумажный фильтр большой порозности (800 нм). Суспензия, подлежащая стерилизующему (заключительному) фильтрованию, должна быть прозрачной и лишь слегка опалесцирующей. Жидкость, хранившуюся на холоде, перед фильтрованием рекомендуется в течение часа выдержать при комнатной температуре, а затем нужный ее объем вылить в стакан фильтровального прибора. В приемном сосуде (колбе) создают разрежение при помощи водоструйного или масляного насоса. Фильтрат проверяют на стерильность (наличие бактерий, грибов) путем посева на МПА, МПБ, среду Сабуро.
Следует отметить, что фильтрование сопровождается адсорбцией вируса на фильтре и приводит к его значительным потерям.
Отбор крови для серологических исследований. Для серологической диагностики необходимо иметь две пробы сыворотки крови (парные сыворотки), взятые в начале и в конце болезни. Первую пробу берут как можно раньше — в инкубационный период или в начале проявления клинических симптомов болезни, вторую — во время выздоровления или через 2...3 недели после заболевания. Брать кровь и готовить сыворотку необходимо стерильно, нельзя применять энтикоагулянты или консерванты, которые могут придать сыворотке антикомплементарность, а в реакции нейтрализации оказать инактивирующее действие на вирус, оказаться токсичными для культур клеток или просто нестерильными. Кровь в объеме 10... 15 мл берут в стерильные пробирки с резиновыми пробками, выдерживают при комнатной температуре до образования сгустка, обводят стеклянной палочкой или другим инструментом и переносят в холодильник при 4 °С на 18... 20 ч. После максимальной ретракции сгустка сыворотку отсасывают, добавляют пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл, проводят высевы на бактериологические среды. Вместо отстаивания в холодильнике можно после обведения кровь центрифугировать.
Серологические методы вирусологической диагностики требуют исследования парных проб сывороток, поэтому необходимо правильно сохранять первые пробы, пока не будут получены вторые. Хранить сыворотки необходимо в холодильнике при 4 °С или в замороженном виде, строго соблюдая порядок нумерации проб и соответствия записей в журнале и на пробах.