Убихиноны (коферменты Q)

27.03.2020

ЛЕКЦИЯ 5.

ПОЛУЧЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ, ВИТАМИНОВ И КОФЕРМЕНТОВ

 

Витамины представляют низкомолекулярные органические со­единения, необходимые для жизнедеятельности организма, син­тез которых в организме либо ограничен, либо отсутствует. Не подлежит сомнению исключительно высокая биологическая ак­тивность витаминов. Потребность в них для организма человека вполне достаточна в очень небольших количествах (от нескольких микрограммов до нескольких десятков миллиграммов в день).

Витамины, не являясь пластическим материалом или источни­ком энергии, служат активными биокатализаторами разных мета­болических процессов в организме. Почти все водорастворимые

витамины, а также жирорастворимый витамин К являются ко-ферментами или кофакторами биохимических реакций. Витами­ны A, D, Е регулируют генетический аппарат клетки. Помимо этого абсолютно каждому витамину свойственна своя, специфи­ческая функция в организме. Все это указывает на незаменимость витаминов для жизнедеятельности организма.

В современных социально-экономических условиях вследствие индустриализации и достижений цивилизации человек изменил ха­рактер питания и стал употреблять много рафинированных и кон­сервированных продуктов, обладающих меньшей витаминной цен­ностью. В качестве примера можно привести муку высших сортов, при производстве которой теряется до 80—90 % всех витаминов. Дру­гой пример, при операции экстрагирования, дезодорирования и осветления растительных масел разрушаются жирорастворимые ви­тамины. Витамины А, Е, К и каротин достаточно устойчивы к тер­мообработке, но весьма чувствительны к свету и кислороду воздуха. Для стран со слабо развитой экономикой дефицит витаминов приобретает массовое явление вследствие достаточно низкого про­житочного минимума для большинства населения этих стран, од­новременно с этим снижается качество питания из-за отсутствия в нем свежих овощей, фруктов, мяса, рыбы.

Широкое распространение полигиповитаминозов, снижение резистентности организма к болезнетворным микроорганизмам, сопровождающееся вредными экологическими факторами (ради­ацией, канцерогенами, промышленными токсинами) — все это повышает роль витаминов в профилактической и лечебной работе врачей, поэтому в экономически развитых странах стали реализо-вываться государственные программы искусственной витамини­зации пищевых продуктов (муки, хлеба, молока, соков и др.).

В основе классификации витаминов (табл. 1) находятся их фи­зико-химические свойства, в соответствии с которыми все вита­мины делят на водо- и жирорастворимые.

Известно, что водорастворимые витамины в тканях не накапли­ваются (за исключением витамина В|₂), из чего следует необходи­мость их ежедневного поступления в организм. Жирорастворимые витамины способны накапливаться в тканях, поэтому их недоста­точность или дефицит встречаются реже. Для них не свойственна и коферментная функция (кроме витамина К). Интересно, что, вы­полняя функцию индукторов синтеза белков, представители жиро­растворимых витаминов проявляют сходство со стероидными гор­монами, особенно это имеет отношение к витамину D. И, наконец, все жирорастворимые витамины являются структурными компонен­тами клеточных мембран, проявляя антиоксидантное действие.

Обращаясь к источникам витаминов, можно сказать, что прио­ритет в этом случае остается за растениями. Не секрет, что на содержание витаминов в пищевых продуктах существенно влияет

Классификация витаминов

Таблица 1

Буквенное обозна­чение	Химическое название	Активная форма витамина	Лечебный эффект
	Водорастворимые витамины
в,	Тиамин	Тиаминпирофосфат (ТПФ), кокарбокси-лаза, тиаминтри-фосфат (ТТФ)	Антиневритный
в2	Рибофлавин	ФМН,ФАД	Витамин роста
Вз	Пантотеновая кислота	KoA-SH, дефосфоКоА, 4-фосфопантетеин	Антидерматитный
В5(РР)	Ниацин	НАД+ и НАДФ+	Антипеллагри-ческий
в6	Пиридоксин	Пиридоксальфосфат, пиридоксамино- фосфат	Антидерматитный
В,2	Кобаламин	Метилкобаламин, дезоксиаденозинко- баламин	Антианемический
с	Аскорбиновая кислота	Аскорбиновая и де- гидроаскорбиновая кислоты	Регулятор мета­болических про­цессов, иммуно­стимулятор
	Жирорастворимые витамины
А	Ретинол	Ретинол/ретиналь	Антиксеро-фтальмический
D	Кальциферол	Эргокальциферол	Антирахити­ческий
Е	Токоферол	а-, (3-, у-, 5-токофе-ролы, токотриенолы	Антиоксидантный
К	Филлохинон	Дифарнезилнафто-хинон	Антигеморраги­ческий

тот или иной сезон календарного года и кулинарная обработка, что опять нас возвращает к вопросу организации рационального и сбалансированного питания.

Научные исследования последних лет показали не только вы­сокую биологическую активность витаминов, но и то, что, как правило, этой активностью обладают не сами витамины, а их производные — коферменты, которые нашли широкое примене­ние в медицинской практике.

Если говорить о производстве основной части витаминной про­дукции, то ведущее положение здесь занимают химические мето­ды, но в ряде производств в качестве их полноправного конку­рента как в нашей стране, так и за рубежом, выступают биотех­нологические методы, использование которых более предпочти­тельно в связи с ужесточением экологических требований к фар­мацевтическому производству. Кроме того, при применении био­технологических методов появляются возможности сокращения части стадий химического синтеза за счет использования высоко­активных штаммов микроорганизмов-продуцентов. Например, производство витаминов В₁₂, В₂, В₃ и D (эргостерина) осуществ­ляется в одну стадию. Также микроорганизмы нашли свое приме­нение и в синтезе витамина С, убихинонов, каротиноидов.

Витамин В₁₂ (кобаламин)

В настоящее время витамин В,₂ получают чисто биотехнологи­ческими методами. Витамин В₁₂ является производным внутрен­него кобальтового комплекса нуклеотида бензимидазола и макро-циклической корриновой системы. Способность синтезировать соединения корриноидной природы широко распространена сре­ди прокариотических микроорганизмов. Так, некоторые мутант-ные штаммы пропионовых бактерий из рода Propionibacterium

способны продуцировать свыше 50 мг витамина В_п на 1 л среды, а в присутствии его предшественника 5,6-диметилбензимидазола (5,6-ДМБ) накапливать до 200 мг на 1 л культуральной жидкости. Культивируют продуценты витамина В|₂ на средах, приготовлен­ных из пищевого сырья (кукурузный и мясной экстракты, соевая и рыбная мука). В настоящее время успешно ведется поиск актив­ных продуцентов, образующих достаточное количество витамина на средах, из непищевого сырья, когда в качестве источника уг­лерода и энергии используются изопропиловыи спирт, метанол и др. Пропионовые бактерии выращивают периодическим методом в анаэробных условиях на среде, содержащей кроме пищевого сырья глюкозу, соли кобальта и сульфат аммония.

В процессе ферментации образуются кислоты, которые затем нейтрализуют, непрерывно подавая в ферментер раствор щелочи. Через 72 ч после начала ферментации в питательную среду вносят предшественник (5,6-ДМБ), так как без добавления последнего вместо витамина В,₂ синтезируются фактор В (кобинамид) и не обладающий терапевтическим эффектом псевдовитамин В₎₂, у ко­торого азотистым основанием служит аденин. Общее время фер­ментации — 6 сут. По ее окончании витамин В₁₂ остается в клетках бактерий, т.е. в биомассе, которую далее сепарируют, а целевой продукт экстрагируют подкисленной водой.

Необходимо отметить, что в качестве новых перспективных раз­работок создан высокопродуктивный штамм Propionibacterium ari, способный в отличие от ранее известных продуцентов вьщелять витамин В|₂ в культуральную среду. Для предотвращения образо­вания коферментной формы витамина В,₂ в качестве стабилиза­тора добавляют нитрит натрия. Далее следуют стандартные стадии выделения и очистки, поэтому подробно на них останавливаться не будем. Полученный продукт используется для изготовления разных лекарственных форм препарата и в производстве поливи­таминных препаратов.

Витамин В₂ (рибофлавин)

ОН ОН ОН

I I I сн₂-сн—сн—сн-сн₂он

Биосинтез флавинов осуществляется как растительными, так и многими бактериальными клетками, а также плесневыми гри-

 

бами и дрожжами. Благодаря именно микробному биосинтезу ри­бофлавина в желудочно-кишечном тракте жвачные животные не нуждаются в этом витамине. У человека синтезирующихся флави-нов недостаточно для предупреждения гиповитаминоза.

Витамин В₂ хорошо растворим в воде, устойчив в кислой сре­де, но легко разрушается в нейтральной и щелочной средах, а так­же под действием УФ-облучения. Для этого витамина характерно функционирование в коэнзимных формах: флавиномононуклео-тид (ФМН) и флавиноадениндинуклеотид (ФАД). Именно на при­мере выделения рибофлавина в культуральную жидкость было открыто явление сверхсинтеза. При промышленном получении рибофлавина используют культуры дрожжеподобных грибов Eremothecium ashbyii и Ashbya gossipii, синтезирующих до 3,8 и 6,4 г/л рибофлавина соответственно. Однако серьезным недостат­ком этих культур является их нестабильность при хранении на твердых средах во всем диапазоне температур — от комнатной до температуры лиофилизации, в результате чего они теряют спо­собность к сверхсинтезу рибофлавина. Поэтому для сохранения активности штамма приходится систематически проводить рассев на твердые среды, отбирая колонии с высокой активностью.

Сейчас вместе с вышеуказанными культурами при промыш­ленном получении рибофлавина в помощью методов использует­ся мутантный штамм продуцент Bacillus subtilis с нарушенной ре­гуляцией синтеза витамина В₂. Этот штамм устойчив к наиболее сильному антиметаболиту рибофлавина — его аминоаналогу ро-зеофлавину и обладает способностью к сверхсинтезу витамина В₂. При культивировании его на среде с мелассой и дрожжевым эк­страктом в культуральной жидкости накапливается 3,5 — 4,5 г/л рибофлавина. При этом время ферментации сократилось в 3 раза. Рибофлавин получают и химическим методом, используя в каче­стве биокатализатора сухие клетки бревибактерий. Причем, если биосинтез с нативными клетками занимает несколько суток, то при биосинтезе с суспензией сухих клеток время синтеза ФАД составляет всего 15—17 ч. важной коферментной формой витамина В₃ является кофермент ацетилирования (КоА). Способностью продуцировать в значитель­ных количествах КоА обладают многие микроорганизмы, в част­ности актиномицеты. Активно внедряются в промышленное про­изводство способы получения пантотеновой кислоты и ее струк­турных компонентов из р-аланина и пантотеата калия с помощью иммобилизованных клеток бактерий, а также достигнуты суще­ственные успехи при получении КоА с использованием мутант-ных штаммов Brevibacterium ammoniagenes, которые позволяют получать КоА в количестве до 3 г на литр.

Аскорбиновая кислота в мировом промышленном производ­стве витаминной продукции в целом занимает наибольшую

 

долю — около 40 тыс. т в год. Ее синтез был разработан швейцар­скими учеными А. Грюсснером и С. Рейхштейном в 1934 г. и ис­пользуется до настоящего времени. Синтез аскорбиновой кисло­ты является многостадийным химическим процессом, в кото­ром только одна стадия представлена биотрансформацией. Эта стадия трансформации d-сорбита в L-сорбозу при участии аце­татных бактерий. Для получения сорбозы используют глубинную ферментацию, когда культуру продуцента Gluconobacter oxydans выращивают в ферментерах периодического режима с мешалкой и барботером для усиления аэрации и массообмена в течение 20 — 40 ч с результатом по выходу сорбозы до 98% исходного количества сорбита в среде. Обычно для достижения такого вы­сокого выхода целевого продукта в питательную среду вносят кукурузный или дрожжевой экстракт в количестве около 20 %. По окончании ферментации сорбозу выделяют из культураль-ной жидкости. Помимо оптимизации среды можно совершен­ствовать и технологическую аппаратуру. Например, переход от периодического культивирования продуцента Gluconobacter oxydans к непрерывному в аппарате колоночного типа увеличи­вает скорость образования сорбозы в 1,7 раз.

В настоящее время широкое использование биотехнологиче­ских процессов позволяет совершенствовать синтез аскорбино­вой кислоты, сокращая многоэтапные и дорогие химические ста­дии. Например, синтез витамина С осуществляют енолизацией его важнейшего промежуточного продукта — 2-кето-Ь-гулоно-вой кислоты, которую, в свою очередь, получают методом двух-стадийного микробиологического синтеза, состоящего из окис­ления d-глюкозы в 2,5-дикето^-глюконовую кислоту (2,5-ДКДГК) и биотрансформации последней в 2-кето-Ь-гулоновую кислоту (2-КГК).

Основными продуктивными микроорганизмами, обеспечива­ющими процессы окисления d-глюкозы в 2,5-ДКДГК и восста­новление последней до 2-КГК, являются мутантные штаммы Erwinia punctata и Corynebacterium sp., при использовании кото­рых выход целевого продукта составляет около 90 % количества глюкозы.

Однако данная технология имеет существенные недостатки, так как при совместном культивировании продуцентов происхо­дит ингибирование синтеза 2-КГК. Поэтому культуральную жид­кость после выращивания продуцента 2,5-ДКДГК стерилизуют, применяя поверхностно-активные вещества (ПАВ), что позво­ляет значительно сократить потери при получении гулоновои кислоты.

Существует и другой биотехнологический способ получения гулоновои кислоты, основанный на синтезе этого продукта штам­мом микроорганизмов рода Gluconobacter из сорбозы, производство которой имеет высокую рентабельность. Способность к син­тезу целевого продукта обусловлено наличием у этого микроорга­низма видоспецифических дегидрогеназ.

Впервые кальциферол был выделен из рыбьего жира в 1936 г. А. Виндаусом и применен при лечении рахита. Он получил назва­ние витамина D₃, так как ранее из растительных масел был выде­лен эргостерин под названием витамин D,, при облучении кото­рого получили витамин D₂ — эргокальциферол (кальциферол — в переводе «несущий кальций»).

В настоящее время кальциферол производят из эргостерина с применением УФ-облучения биотехнологическим методом. В про­цессе преобразования эргостерина в эргокальциферол принима­ют участие микроорганизмы. Особенно богаты эргостерином клетки дрожжей всех видов и плесневые грибы. В сухой биомассе дрожжей содержится 5—10% эргостерина.

В качестве промышленного источника эргостерина используют дрожжи Saccharomyces cerevisiae вследствие высокого содержания в них эргостерина. В анаэробных условиях культивирования про­исходит накопление в клетках дрожжей сквалена (предшествен­ника эргостерина). Индукция синтеза эргостерина начинается при строго определенной концентрации кислорода от 0,03 до 2 %. При этом среда должна содержать избыток углеводов и малое количе­ство азота. По окончании процесса спиртового брожения дрожжи отделяют от барды и вносят в питательную среду необходимое количество источников углерода, азота и фосфора. Ферментацию ведут в аэробных условиях 12 —20 ч, по окончании которой клет­ки дрожжей отделяют от культуральной жидкости, добавляют ан-тиоксиданты и сушат. Обычно в такой биомассе содержание эрго­стерина достигает 1,5%.

При дальнейшем УФ-облучении эргостерина получают вита­мин D₂, который либо используется как пищевая добавка, либо подвергается дальнейшей обработке с целью получения кристал­лического витамина D₂.

 

При получении эргостерина из дрожжеподобных грибов рода Candida сухую массу грибов экстрагируют петролейным эфиром для извлечения остаточных углеводородов. Полученная таким об­разом липидная фракция называется «микробный жир» и являет­ся побочным продуктом микробиологической промышленности. Эта фракция может быть использована как источник не только эргостерина, но и убихинона, а также других жирорастворимых соединений. Для грибов рода Candida характерно, что при перехо­де от периодического культивирования на углеводородах к непре­рывному в клетках сохраняются как уровень образования стери-нов, так и относительное содержание в них эргостерина.

Использование отходов крахмало-паточного производства — кукурузного экстракта и зеленой патоки позволяет снизить себе­стоимость получаемой продукции, а применение в качестве ис­точника углерода целлобиозы, образующейся при утилизации от­ходов целлюлозы, позволяет в несколько раз увеличить синтез каротиноидов у штаммов культуры Blakslea trispora.

Убихиноны (коферменты Q)

О Н₃СО. JL /СН₃

Убихиноны в последнее время вызывают интерес как перспек­тивные лечебные препараты. С одной стороны, они синтезируют­ся в организме животных и человека, делая необязательным их поступление с пищевыми продуктами, что отличает их от группы витаминов.

С другой стороны, недостаток убихинонов ведет к нарушениям в обменных процессах, характерных для проявлений недостаточ­ности витаминов групп В и К. Убихиноны являются регуляторами тканевого дыхания, окислительного фосфолирирования в цепи транспорта электронов и за счет высокой специфичности прояв­ляют свой регуляторный эффект.

С практической стороны наибольший интерес вызывают выс­шие гомологи: убихинон-9 (KoQ₉) и убихинон-10 (KoQ|₀)- Убихи-нон-10 является коферментом организма человека, вследствие чего на его основе создан лекарственный препарат Ubichynon composi-tum, проявляющий общетонизирующее, антиоксидантное и им­муностимулирующее действие.

В производстве убихинонов применяются биотехнологические методы, в основе которых лежит экстракция KoQ из биологиче­ского материала. В промышленном производстве убихинонов в ка­честве субстрата используются как растительные ткани (каллус риса или опухолевые ткани Carthamus tinctorius), так и микроор­ганизмы с высоким содержанием убихинонов, например дрожжи Cryptococcus curvatus и грибы Candida maltosa.

В настоящее время используется биотехнология получения уби-хинона-9 и эргостерина из микробных липидов, являющихся по­бочным продуктом крупного производства белково-витаминного концентрата при выращивании грибов Candida maltosa.

Установлено, что биомасса уксуснокислых бактерий (Gluco-nobacter oxydans), которые используются в производстве аскор­биновой кислоты на этапе окисления d-сорбита в L-сорбозу, со­держит значительное количество KoQ,₀ без примеси его гомоло­гов. Причем, с одной стороны, эта биомасса является отходом производства аскорбиновой кислоты, с другой стороны, штаммы Gluconobacter oxydans в биомассе характеризуются наибольшей окислительной активностью по сорбиту. Этот уникальный факт позволил разработать и внедрить совместную технологию получе­ния L-сорбозы и экстракции убихинона-10 из отсепарированной биомассы с последующей очисткой и с выходом целевого про­дукта до 85 %.

Аминокислоты

Все более ухудшающиеся экологические условия создают для населения планеты новую тяжелую проблему — выживание. Од­новременно к этой проблеме добавляются такие факторы, как бедность, плохое питание, неуверенность в завтрашнем дне, стрес­сы. Хорошо изучено благоприятное действие аминокислотных сме­сей на иммунную систему и различные органы. Помимо этого аминокислоты заменяют насыщенные белком пищевые продук­ты, недоступные для большинства населения низкоразвитых стран. Таким образом, аминокислоты становятся в настоящее время од­ним из важнейших факторов выживания населения Земли.

Все 20 аминокислот хорошо изучены (методы их синтеза давно подробно описаны) и являются составными элементами белков или мономерами для построения природных полипептидов. Изве­стно также, что эти соединения существуют в виде оптических изомеров. При этом надо отметить, что аминокислоты в белках находятся в L- и D-формах (L,D-стереоизомеры), причем биоло­гически активны в основном L-формы, а D-стереоизомеры могут быть даже токсичными. Все аминокислоты делятся на незамени­мые и заменимые, в зависимости от того, синтезируются они в организме человека или нет. Приблизительно половина из 20 ами­нокислот являются незаменимыми, а остальные, соответствен­но, заменимыми.

Незаменимые аминокислоты имеют широкий спектр приме­нения как в сельском хозяйстве (кормовые балансирующие до­бавки), так в пищевой (биологически активные добавки) и меди­цинской (лекарственные препараты и смеси для парентерального питания) промышленности.

В сельском хозяйстве аминокислоты используются для балан­сировки кормов по аминокислотному составу, чтобы в организм животных и птиц они поступали в том соотношении, в каком они находятся в белках этих животных и птиц. Введение амино­кислот в корма обеспечивает максимальную скорость синтеза белка и, соответственно, рост биомассы животного. Это очень важно в случае «скороспелого» животноводства, свиноводства и птицеводства.

В питательные продукты для человека также можно добавлять незаменимые аминокислоты. Это целесообразно делать или по медицинским показаниям, или в силу каких-либо соображений, когда человек питается только растительной пишей (раститель­ными белками). Эту пищу можно оптимизировать и улучшить ее питательные свойства, сбалансировав ее по аминокислотному составу путем добавления туда лизина, треонина, метионина (на­пример, в пищу для вегетарианцев). Кроме того, что аминокисло­ты имеют огромное значение для нашей пищи, они также широко используются и в традиционной клинической практике (табл. 2).

 

Таблица 2

Моно- и комплексные лекарственные препараты на основе аминокислот

Препарат	Действие	Применение
Глицин	Обладает ноотропным и седативным эффектом; снижает проявления абстиненции у больных алкоголизмом	В клинике нервных и психических за­болеваний; в нарко­логии — для стимуля­ции умственной дея­тельности (некоторые студенты проводят терапию глицином перед экзаменами)
Глугамин	Обеспечивает формирова­ние высших психических функций; участвует в многообразных реакциях переаминирования, т.е. обеспечивает синтез других заменимых аминокислот; активно связывает образующиеся в процессе метаболических реакций ионы аммония, которые являются токсичными и накопление их в клетках головного мозга вызывает процесс возбуждения	В клинике нервных и психических за­болеваний, а также при задержке умственного развития у детей; входит в состав комплексных препаратов для профи­лактики стресса, например препарат глутамивит наряду с витаминами и микроэлементами содержит также и глутами новую кислоту

Окончание табл. 2

Препарат	Действие	Применение
Метионин	Является донором металь­ной группы в разных био­химических реакциях. В частности, при участии метионина осуществляется синтез холина (соединение, входящее в состав клеточ­ных мембран) из жиров; обладает липотропным и гепатропным эффектом	При циррозах и ге­патитах печени и лицам преклонного возраста, у которых имеются признаки атеросклероза
Цистеин	Приостанавливает процесс помутнения хрусталика	В начальных стадиях развития катаракты; вхо­дит в состав глазных ка­пель— витайодурола и др.
Тимоген	Иммуностимулирующее; усиливает неспецифи­ческую резистентность организма	Для стимуляции репара-тивных процессов после тяжелых травм (в том числе переломов костей)
Цереброли-зин	Регулирует процессы регенерации в головном мозге	После травм головного мозга; инсультов и ише-мического голодания головного мозга, а также при задержке умствен­ного развития у детей
Румалон	Корректирует метаболизм костной и хрящевой ткани	При артритах и артрозах
Раверон	Регулирует обмен веществ в предстательной железе	Воспалительные болезни и гиперплазия предстательной железы
Эмбриобласт	Усиливает метаболические процессы	Для профилактики и коррекции возрастных изменений кожи лица и шеи
Препарат NCTC-109	Создает благоприятную среду для метаболических процессов	Для ускорения зажив­ления и восстановления кожных покровов

Перечень препаратов на основе аминокислот и их комплексов постоянно растет и расширяется. Очень хорошую перспективу для успешного развития имеют препараты для парентерального пита­ния, содержащие комплексы аминокислот. Они назначаются, когда питание «естественным» образом противопоказано, так как сти­мулирует секрецию пищеварительных желез. Например, при остром панкреатите человек не должен ни пить, ни есть, поскольку любая стимуляция секреции может привести к самопереварива­нию поджелудочной железы.

Тенденция сегодняшнего дня — использование препаратов, содержащих весь комплекс аминокислот (или, по меньшей мере, 18 из них), т.е. в оптимальном для человеческого организма соот­ношении. В основном это импортные препараты: аминоплазмаль, кетостерил, валин (Германия); аминостерил КЕ (Финляндия); аминосол (Югославия). Некоторые из этих препаратов помимо аминокислот содержат также глюкозу и витамины. Соотношение аминокислот в них оптимальное. В организме человека в зависи­мости от возраста синтезируются белки соответствующего соста­ва, например аминокислотный состав этих препаратов для детей приближается к составу грудного молока матери, для взрослых он несколько иной.

Установлено, что в любом органе и ткани имеются свои пеп­тиды — соединения, состоящие из небольшого количества ами­нокислотных остатков, которые образуются и выделяются при их разрушении, стимулируют, как правило, и процессы их регене­рации. В соответствии с этим из того или иного органа животных готовят экстракты и на их основе — лекарственные препараты, которые используют для терапии заболеваний этих органов. Об­щим для всех этих препаратов является то, что действующим на­чалом у них являются пептиды. В частности, в препарате на основе тимуса — тимогене таким действующим началом является глута-милтриптофан (дипептид, состоящий из глутаминовой кислоты и триптофана). Аминокислоты также входят в состав комплексных препаратов, применяемых в косметологии.

Существуют так называемые космоцевтические медицинские препараты, для получения которых используется фармацевтиче­ское сырье, к чистоте которого предъявляют повышенные требо­вания. При этом известно, что особочистыми являются вещества, полученные биотехнологическими методами, например с помо­щью специально выведенных штаммов-микроорганизмов.

Иллюстрацией может служить препарат эмбриобласт, получа­емый из эмбриональной зубной ткани овец, содержащий как био­стимуляторы (факторы роста, цитокины и др.), так и необходи­мый «строительный материал» — аминокислоты, нуклеотиды, витамины, минералы.

В настоящее время аминокислоты получают методами:

• биологическим (применение гидролиза белоксодержащих суб­стратов);

• химическим (тонкий органический синтез);

• химико-энзиматическим (энзиматическая трансформация хи­мически синтезированных предшественников аминокислот с об­разованием биологически активных L-изомеров);

• микробиологическим (получение L-аминокислот). Древнейший способ получения аминокислот — кислотный,

щелочной или ферментативный гидролиз белоксодержащих суб­стратов (мясо, молоко и т.д.). При высокой температуре белок расщепляется на соответствующие аминокислоты или фрагмен­ты, состоящие из нескольких аминокислот. При этом образуется смесь аминокислот и пептидов. Извлечение из этой смеси какой-либо определенной аминокислоты — довольно сложная, но тем не менее выполнимая задача.

Само по себе сырье (мясо и белок молока — казеин) — дорого­стоящий продукт, и этот метод применяется, когда имеют дело с «бросовым» сырьем, т.е. с отходами производства (таким сырьем являются рога, копыта, волосы, перья и пух, состоящие из кера­тина, в котором содержится очень много серосодержащей кислоты цистеина, и — в небольших количествах — других аминокислот).

Следующий способ получения чистых аминокислот — хими­ческий синтез. Их синтезируют подобно другим органическим кислотам, это не сложно. Однако в процессе химического синтеза получается смесь D- и L-стереоизомеров (иногда получается и большее количество изомеров), а как известно, в белках человека биологически активны только L-стереоизомеры аминокислот, поэтому существуют трудности разделения этих изомеров. Кроме того, химическое производство аминокислот, как правило, свя­зано с использованием дорогостоящего оборудования и нередко агрессивных токсических соединений в качестве исходного сырья. Процесс протекает при высокой температуре, требует дорогосто­ящих катализаторов и как всякое химическое производство со­провождается образованием побочных продуктов, загрязняет окру­жающую среду, небезопасно и небезвредно для обслуживающего персонала.

Тем не менее некоторые аминокислоты получают химическим синтезом, например глицин, а также D-, L-метионин, D-изомер которого малотоксичен, поэтому медицинский препарат на осно­ве метионина содержит D- и L-формы, хотя за рубежом в меди­цине используется препарат, содержащий только L-форму метио­нина. Там рацемическую смесь метионина разделяют биоконвер­сией D-формы в L-форму под влиянием специальных ферментов живых клеток микроорганизмов.

Следующий способ получения аминокислот — химико-энзиматический. Как видно из названия, этот метод получения ами-

нокислот предполагает два этапа. Сначала химическим методом синтезируется «предшественник» — соответствующая карбоновая кислота, а затем эта карбоновая кислота (обычно в присутствии аммиака) превращается в соответствующую аминокислоту. Эта биотрансформация (биоконверсия) осуществляется ферментами живых клеток. Причем полученные L-стереоизомеры аминокис­лот сами по себе необходимы для жизнедеятельности этих кле­ток, т.е. фактически этот способ наполовину биотехнологический. Таким методом получают, например, аспарагиновую кислоту (на основе фумаровой кислоты). Раствор фумаровой кислоты пропус­кают через колонки, в которых иммобилизованы или ферменты, или клетки микроорганизмов с высокой активностью аспартазы, например, Escherichia coli или Serratia marcesceus; туда же подается аммиак и осуществляется биотрансформация.

Аналогичным образом на основе коричной кислоты получают фенилаланин (L-стереоизомер): сн₂-сн—соон

используя для этого дрожжевые клетки. Химико-энзиматически можно производить практически все аминокислоты, однако из-за дороговизны и сложности получения соответствующих органиче­ских кислот-предшественников этот метод не всегда экономиче­ски выгоден и в большинстве случаев уступает методу прямого микробиологического синтеза.

Четвертый способ получения аминокислот — их прямой мик­робиологический синтез — целиком основан на использовании биообъектов (т.е. является полностью биотехнологическим). В ка­честве биообъектов в нем применяются штаммы-продуценты ами­нокислот. Этим методом аминокислоты чаще всего получают на основе Escherichia coli (кишечная палочка — симбионт человека), Bacillus subtilis (сенная палочка — почвенный микроорганизм) и Corynebacterium glutamicum (почвенный микроорганизм).

Все эти микроорганизмы на сегодняшний день прекрасно изу­чены. Известна полная нуклеотидная последовательность всего их генома. Для кишечной палочки разработаны многообразные спо­собы генетического обмена, позволяющие легко комбинировать разные гены и изменять процесс метаболизма. В меньшей степени это относится к Bacillus subtilis, и еще в меньшей степени к Corynebacterium glutamicum.

Использование этих микроорганизмов для получения амино­кислот основано на их способности самостоятельно синтезиро­вать все 20 аминокислот. Также они являются гетеротрофными бактериями, которые в качестве источника углерода используют органические соединения (углевод или какую-нибудь органиче­скую кислоту), а все остальные компоненты получают из неорга­нических соединений.

Применение микроорганизмов гетеротрофов позволяет суще-; ственно сократить по времени процесс ферментации. Так, кишеч­ная палочка в богатой питательной среде делится каждые 20 — 30 мин, коринебактерии — каждый час. В бедных средах — время регенерации в два раза больше (1 ч для кишечной палочки, 1,5 — 2 ч для коринебактерии и сенной палочки).

Вместе с тем существуют бактерии, так называемые ауксо-трофные мутанты — микроорганизмы, которые, с одной стороны, утратили способность самостоятельно синтезировать необходимые для построения всех компонентов своей клетки разные аминокис­лоты, а с другой — приобрели способность к сверхсинтезу целевой аминокислоты. Такие мутанты получают либо воздействием раз­личных мутагенов физической и химической природы на исход­ную культуру микроорганизма с последующей селекцией штамма по заранее заданным признакам, либо методами генной инженерии.

Известно, что клетки бактерий синтезируют аминокислоты для удовлетворения собственных потребностей (синтез белка и другие метаболические процессы); синтезируется их в клетках бактерий определенное количество. В процессе эволюции (естественного от­бора) выживали только те формы, в которых метаболические про­цессы протекали наиболее экономно, и это обеспечивалось за счет механизмов регуляции этих процессов.

Известно, что в регуляции и управлении метаболическими процессами используется принцип обратной связи. Существуют два уровня (механизма) регуляции биосинтеза конечного (целе­вого) продукта — ретроингибирование и репрессия. На первом уровне образующаяся в цепи последовательных реакций амино­кислота ингибирует активность одного из начальных ферментов собственного синтеза. Если этого механизма недостаточно и ко­нечный продукт (аминокислота) все равно присутствует в избыт­ке, то включается второй механизм регуляции и в результате по* давляется (репрессируется) образование всего комплекса фермен­тов соответствующей биосинтетической цепи. На примере био­синтеза аминокислоты треонина:

НО NH₂ II СН3СНСНСООН

можно показать, как реализуются эти принципы в клетках ки­шечной палочки. Треонин, а также лизин и метионин относятся к семейству аспарагиновой кислоты. В клетках бактерий сначала син­тезируется аспарагиновая кислота:

NH₂ I НООС-СН2-СН-СООН

а затем на ее основе синтезируются треонин, метионин и лизин (поэтому они и объединены в семейство аспарагиновой кислоты). Синтез каждой из этих аминокислот осуществляется в несколько этапов с образованием промежуточных соединений. Каждый из этих этапов катализируется белком-ферментом, синтез которого конт­ролируется (кодируется) соответствующим геном, в нуклеотидной последовательности которого записана структура этого белка.

Первая реакция синтеза этих аминокисл