Лекция_Основы ферментативной кинетики. Кинетический анализ схемы БриГгса-Холдейн

Для односубстратных ферментативных процессов простейшей является схема предложенная Бриггсом и Холдейном:

Кинетический анализ данной схемы, представленный ниже, приводит к основополагающему уравнению ферментативной кинетики. В классическом варианте взаимодействие фермента с продуктом с образованием комплекса ЕР, не учитывается. Очевидно, что скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса (ES). Используя основной постулат химической кинетики и принцип аддитивности, можно записать уравнения для скорости образования (V _обр) и расходования (V _расх) комплекса ES. В условиях стационарного (квазистационарного) режима протекания процесса изменения концентрации ES в системе не происходит, следовательно, V _обр = V _расх.

Разделяя постоянные и переменные параметры, приходим к уравнению:

(1)

Во время реакции фермент в системе существует в двух формах – в свободной (E) и в форме фермент-субстратного комплекса (ES):

Экспериментально определить концентрацию свободной формы фермента [Е] практически невозможно. Ее можно выразить через известные параметры:

После преобразований, получаем

(2)

Определить стационарную концентрацию комплекса ES возможно при помощи селективного ингибитора: , но эта процедура имеет существенную экспериментальную сложность. Возникает необходимость выразить [ES] с помощью других кинетических параметров.

Очевидно, что скорость ферментативной реакции будет пропорциональна стационарной концентрации ES. Предположив, что реакция распада комплекса ES с образованием продукта является скоростьлимитирующей, получаем скорость ферментативного процесса:

.

(3)

Экспериментальная зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата имеет вид кривой с насыщением, изображенной на рисунке 1.

Данный вид кривой объясняется тем, что любой фермент имеет предельную скорость превращения субстрата в продукт, которая характеризуется оборотностью фермента. Например, значение оборотности каталазы составляет примерно 40 000 молекул. Это означает, что 40 тыс. молекул Н₂О₂ разлагается одной молекулой фермента за одну секунду.

Рассмотрим следующий пример. При соотношении [S]₀/[E]₀ = 1, стационарная концентрация свободной формы фермента Е будет значительно выше стационарной концентрации комплекса ES. Допустим, 97% от [E]₀ составляет [E], а 3% - [ES]. Если соотношение увеличивается (начальная концентрация субстрата выше), то стационарная концентрация Е уменьшается, а ES – увеличивается. При очень большом значении соотношения [S]₀/[E]₀ в реакционной смеси концентрация [ES] будет приближаться к 100% от [E]₀, а E будет практически отсутствовать. Дальнейшее увеличение концентрации субстрата не будет приводить к увеличению [ES], а значит, и скорости ферментативного процесса. Это значит, что есть предельная скорость ферментативной реакции и она равна:

.

(4)

Подставим (3) и (4) в уравнение (2) и выполним преобразования, выразив V₀, п олучаем уравнение (5) – уравнение Михаэлиса-Ментен.

(5)

Как видно, это уравнение включает два переменных параметра – начальную концентрацию субстрата S₀, которая известна по условиям опыта, и начальную скорость V₀, которая должна быть достоверно определяема используемым методом, и два константных. Следует отметить, что так как одним из условий применимости уравнения Михаэлиса-Ментен является постоянство концентрации субстрата, кинетику исследуют на начальном этапе превращения, при малой степени превращения субстрата, когда его концентрация еще может считаться неизменной.

Константы, входящие в уравнение, К_M и V_max, могут быть определены при обработке массива известных кинетических данных (зависимости V₀ от [ S ] ₀), о чем пойдет речь дальше.

V_max по определению равна скорости реакции при насыщении субстратом всех молекул фермента, то есть, это максимальная скорость при данной концентрации фермента в исследуемых условиях. Ее размерность совпадает с размерностью начальной скорости, входящей в уравнение, например, моль (л∙с)^-1.

K_M – константа Михаэлиса имеет размерность концентрации и равна такой концентрации субстрата, при которой скорость реакции равняется половине максимальной:

Очевидно, что величина K_M зависит от соотношения констант скорости элементарных стадий (см. уравнение 1). Рассмотрим предельные случаи.

1)

Равновесие на первой стадии устанавливается намного быстрее протекания второй стадии. В выражении для константы Михаэлиса можно пренебречь скорость процесса в целом определяется K_S = k_-1/k₁ – константой равновесия, константой диссоциации фермент-субстратного комплекса. Очевидно, что чем она выше, тем ниже скорость:

2)

Если вторая стадия ферментативного процесса существенно быстрее распада фермент-субстратного комплекса, то в уравнении (1) можно пренебречь и константа Михаэлиса трансформируется в кинетическую константу K_k = k₂/k_{1 ,} характеризующую соотношение скоростей образования и расходования фермент-субстратного комплекса.

3)

В ситуации, когда вторая стадия существенно быстрее первой, нельзя говорить о квазистационарной концентрации ES и рассматриваемый подход оказывается некорректным.

Если же соотношение констант таково, что пренебречь никакой из них нельзя, используют константу Михаэлиса без изменений.

Уравнениями, совпадающими по форме с уравнением Михаэлиса-Ментен, могут описываться и более сложные случаи кинетики, не соответствующие схеме Бриггса-Холдейна. Тогда выражения для К_M и V_max имеют более сложный вид.

Физический смысл констант уравнения Михаэлиса-Ментен.

По аналогии с K_S, K_M можно рассматривать как меру сродства субстрата к ферменту.

V_max характеризует оборотность фермента. Действительно, более высокая скорость при одной и той же концентрации фермента будет наблюдаться в том случае, если фермент превращает больше молекул субстрата в единицу времени. Но максимальная скорость зависит и от концентрации, и использовать ее для сравнения разных ферментов может быть неудобно. Поэтому вводят каталитическую константу

В простейшем случае она совпадает с .

Если концентрация фермента дана в моль/л (для чего необходимо знать его молекулярную массу), а скорость определена в моль (л∙с)^-1:

То есть, данная константа численно характеризует оборотность фермента.

Так как V_max и K_M являются константами, их используют для того, чтобы характеризовать активность ферментов.