Иммуногистохимическая экспрессия E- и N-кадгерина при узловой гиперплазии предстательной железы и раке предстательной железы
Immunohistochemical expression of E- and N-Cadherin in nodular prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma
Rania Abdallah Abdallah, Asmaa Gaber Abdou, Moshira Abdelwahed, Hend Ali
Department of Pathology, Faculty of Medicine, Menoufia University, Shebein El Kom, Egypt
Справочная информация: Для объяснения развития узловой гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) были предложены различные теории. Эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) - это физиологический процесс, при котором эпителиальные клетки теряют свою полярность и межклеточную адгезию и приобретают
мезенхимальный фенотип.
Цель: целью настоящего исследования является изучение потенциальной роли E- и N-кадгерина в индукции EMT при ДГПЖ и раке предстательной железы.
Методы: это исследование было проведено на 55 случаях ДГПЖ и 20 случаях рака предстательной железы для оценки иммуногистохимической экспрессия E и N кадгеринов.
Результаты: Большинство случаев ДГПЖ (54/55 случаев, 98,2%) и всех случаев рака простаты показали положительную экспрессию N-кадгерина в эпителии и строме простаты. Высокий процент экспрессии N-кадгерина стромальными клетками был достоверно выше в случаях с раком простаты по сравнению с ДГПЖ. Высокий процент экспрессии N-кадгерина эпителиальными клетками группы рака был достоверно
связан с молодым возрастом, в то время как его высокая экспрессия стромальными клетками была в значительной степени связана с мультицентричностью. Около 96,4% ДГПЖ и 75% карциномы предстательной железы показали положительную экспрессию Е-кадгерина со значительной вариантностью. Нет значительной связи между E-cadherin
и N ‑ кадгерины как при ДГПЖ, так и при раке предстательной железы.
Выводы: более выраженная экспрессия N-кадгерина в
случаях ДГПЖ и карциномы простаты в эпителиальном и стромальном компонентах может указывать на возникновение EMT при этих заболеваниях. Это также
открывает новые возможности для лечения этих пациентов путем нацеливания на молекулу N-кадгерина. Отсутствие обратной связи между Е-кадгерином и
N-кадгерины при ДГПЖ и раке предстательной железы могут указывать на то, что переключение кадгеринов не является существенным шагом для развития EMT.
Ключевые слова: E-кадгерин, эпителиально-мезенхимальный переход, N-кадгерин, узловая гиперплазия предстательной железы, рак предстательной железы.
Введение
Доброкачественнакя гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) является распространенным хроническим пролиферативным заболеванием мужской половой системы, характеризующееся чрезмерным ростом ткани предстательной железы, и ее заболеваемость увеличивается с возрастом. [1] В Египте ДГПЖ составляет 41,31% от
всех заболеваний предстательной железы. [2]
Рак предстательной железы (РПЖ) является распространенной злокачественной опухолью мужской половой системы, и считается наиболее распространенным раком у мужчин в Соединенных Штатах. [3] В Египте на РПЖ приходится 48,01% от всех поражений предстательной железы и 61,63% от всех злокачественных новообразований урогенитального тракта у мужчин.[2]
Кадгерины являются кальций-зависимыми молекулами, ответственными за межклеточную адгезию и включают более 80 представителей. [4] Классические кадгерины - это подсемейство кадгеринов, которые опосредуют адгезию между эпителиальными клетками, поддерживающими целостность ткани и клеточную полярность в дополнение к их центральной роли в эмбриогенезе. [4,5] E- и N-кадгерины относятся к семейству классических кадгеринов. [6] Е-кадгерин экспрессируется на поверхности всех эпителиальных клеток, N-кадгерин обнаружен в нервной ткани, фибробластах, клетках скелетных и сердечные мышц а также в эндотелиальных клетках. [7]
Хотя ДГПЖ является распространенным заболеванием, его точный патогенез остается загадкой и, таким образом, нет окончательного и эффективного лечение этого заболевания. [8,9] Были предложены различные теории пытающиеся объяснить патогенез ДГПЖ, включая эффект медиаторов воспаления, [10,11] дефекты стволовых клеток, [12] пробуждение эмбриональных клеток с изменением взаимодействия между клетками эпителия предстательной железы и строма, [13] гормональный дисбаланс, [14] и усиление влияния трансформирующего фактора роста-β (TGF ‑ β). [15] Некоторые исследования связывают ДГПЖ с процессом эпителиально-мезенхимального переход (EMT). [16]
EMT – это физиологический процесс, при котором эпителиальные клетки теряют их полярность и межклеточную адгезию и приобретают мезенхимальный фенотип, повышающий их подвижность, устойчивость к апоптозу и чрезмерный синтез внеклеточного матрикса. [17,18] Во время этого процесса происходит перепрограммирование эпителиальных клеток, которые теряют эпителиальные маркеры, такие как E-кадгерин и кератины, и приобретают мезенхимальные маркеры такие как виментин, α-гладкомышечный актин и N-кадгерин. [17,19] Этот процесс играет роль в эмбриогенезе, заживлении тканей и фиброзе в дополнение к метастазированию рака. [19]
Целью данного исследования является оценка иммуногистохимической экспрессии E- и N-кадгеринов, членов классического семейства кадгеринов, при ДГПЖ и раке предстательной железы для исследования их потенциальной роли в индукции EMT при этих заболеваниях.
Материалы и методы
Это ретроспективное исследование 75 образцов простаты от египетских пациентов, Кафедры медицинского факультета Университета Менуфия, в период с января 2014 года по октябрь 2016 года. Они были выбраны случайным образом, исходя из наличия
парафиновых блоков для серийных срезов.
Изученные случаи включены
• 55 случаев ДГПЖ, которые были удалены хирургическим путем как в ходе трансуретральной резекции простаты (ТУР) (44 случая), так и в ходе аденомэктомии (8 случаев) и биоптаты простаты (3 случая)
• 20 случаев аденокарциномы предстательной железы, простата была удалена в размере простатэктоми с предшествующей биопсией (17 случаев) и ТУР (3 случая).
Из каждого репрезентативного парафинового блока сделано несколько
срезов толщиной 4 мкм помещённые на:
• Стёкла для рутинного окрашивания гематоксилином и эозином (H и E)
• Положительно заряженные стёкла для иммуногистохического окрашивания.
Гистопатологическое исследование
Гистопатологическое исследование окрашенных участков H и E для подтверждения диагноза и определения следующих покзателей:
В группе доброкачественной гиперплазии предстательной железы
Соотношение железы и стромы - случаи были разделены на равные
соотношение железы к строме (1: 1), преобладание железы и преобладание стромы. [20] Базально-клеточная гиперплазия, плоскоклеточная метаплазия, эктатические кровеносные сосуды, острое воспаление, хроническое воспаление и инфаркт также оценивалсь.
В группе аденокарциномы предстательной железы
• Центричность: мультицентричность или одиночный узел
• Наличие или отсутствие некроза или периневральной инвазии.
Шкала Глисона
Случаи были классифицированы в соответствии с последней модификацией шкалы Глисона. [21] Для статистических целей, случаи с баллом Глисона 6 и 7 были объединены против случаев с баллом Глисона 8, 9 и 10.
Иммуногистохимия
Несколько парафиновых срезов толщиной 4 мкм от каждого случая были окрашены иммуногистохимическим методом (один для N-кадгерина и другой для E-кадгерина). Метод, используемый для иммуноокрашивание представлял собой амплифицированную стрептавидин-биотиновую систему.
• Два первичных антитела были использованы
• N ‑ cadherin - это антитело против человеческого кадгерина у мышей. Антитело (Neural cadherin, 13B154, US Biological). Получается как 0,1, концентрированный и разбавленный
фосфатный буферный солевой раствор (PBS) в разведении 1: 150
• E ‑ cadherin - это мышиное моноклональное антитело (MS ‑ 9470 ‑ R7, Thermo Scientific, США). Полученое как 7,0 мл (готовый к использованию для иммуногистохимии).
В этой системе были использованы два реагента, биотинилированный вторичный антииммуноглобулин, который является очищенным моноклональным анти-мышиным иммуноглобулином G (Thermo Scientific, NOS ‑ 3F7 ‑ B11 B5), способный связываться с первичным антителом и комплексом ферментов стрептавидин-биотин.
Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием универсального Dakocytomation меченный стрептавидин-биотин ‑ 2 системы, пероксидаза хрена (система LSAB ‑ 2, комплект HRP, № по каталогу K0679). Все блоки были депарафинизированы с использованием ксилола, а затем регидратированы в уменьшающихся концентрациях этилового спирта. Извлечение антигена с помощью микроволнового нагрева (20 мин; 10 ммоль / цитратный буфер, рН 6,0) с последующим ингибированием эндогенной активности пероксидазы (перекись водорода 15 мин). Первичные антитела были применены на стёкла и инкубированы в течение ночи при комнатной температуре в камере влажности. Наконец, обнаружение связанного антитела было достигнуто с использованием модифицированного меченного авидин ‑ биотина реагента в течение 20 мин, затем проводилось промывание PBS. 0,1% раствором диаминобензидином в течение 5 минут в качестве хромогена. Стёкла окрашивали гематоксилином Майера в течение 5 - 10 мин. Ткани, полученные из рака толстой кишки и меланомы были использованы в качестве положительного контроля для Е-кадгерина и N-кадгерина, соответственно.
Интерпретация экспрессии N-кадгерина и E-кадгерина
Исследованные случаи были обозначены как положительные для N-кадгерина, когда коричневое окрашивание было замечено либо в клеточной мембране, либо цитоплазме в любом количестве клеток. [22] Экспрессию N-кадгерина оценивали как в эпителиальных, так и в стромальных клетках, отдельно. Только мембранное коричневое окрашивание считалось положительным в случае Е-кадгерина в любом количестве клеток. [22] Экспрессия была оценена в эпителиальных клетках только потому, что было сложно оценить мембранную экспрессию в стромальных клетках.
Процент экспрессии как для N кадгерина, так и для E-кадгерина оценивали в эпителиальных и стромальных клетках для N-кадгерин и только в эпителиальных клетках для Е-кадгерина. Среднее значение, было, затем рассчитано и использовано как точка отсечения для деления на высокую (> медиану) и низкую (≤ медиану) экспрессию.
Статистический анализ
Данные были собраны, сведены в таблицу и статистически проанализированы используя персональный компьютер с «Статистическим пакетом Программа социальных наук (SPSS) версии 20 (корпорация IBM, Армонк, Нью-Йорк, США). Точные тесты Хи-квадрат и Фишера были использованы для оценки качественных данных, тогда как Тест Уитни был использован для оценки количественных данных. Р <0,05 считали статистически значимым.
Результаты
Представлены данные ДГПЖ и рака предстательной железы. Таблицы 1 и 2 соответственно.