Применение денатурирующих агентов в биологических исследованиях и медицине

1. В биохимических исследованиях перед определением в биологическом материале низкомолекулярных соединений обычно из раствора удаляют белки. Для этой цели чаще всего используется трихлоруксусная кислота (ТХУ). После добавления ТХУ в раствор денатурированные белки выпадают в осадок и легко удаляются фильтрованием (табл. 1).

2. В медицине денатурирующие агенты часто применяют для стерилизации медицинского инструмента и материала в автоклавах (денатурирующий агент - высокая температура) и в качестве антисептиков (спирт, фенол, хлорамин) для обработки загрязненных поверхностей, содержащих патогенную микрофлору

Таблица 1.2. Реагенты и условия, вызывающие денатурацию белков

ОБРАТИМОСТЬ ДЕНАТУРАЦИИ

В пробирке (in vitro- переводится как в стекле. В широком смысле обычно трактуется как термин обозначающий в условиях вне организма) чаще всего это – необратимый процесс. Если же денатурированный белок поместить в условия, близкие к нативным, то он может ренатурировать, но очень медленно, и такое явление характерно не для всех белков.

В условиях in vivo, (в организме), возможна быстрая ренатурация. Это связано с выработкой в живом организме специфических белков, которые «узнают» структуру денатурированного белка, присоединяются к нему с помощью слабых типов связи и создают оптимальные условия для ренатурации. Такие специфические белки известны как «белки теплового шока » или «белки стресса ».

БЕЛКИ СТРЕССА, ИЛИ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ШАПЕРОНЫПРЕДОТВРАЩАЮЩИЕ ДЕНАТУРАЦИЮ БЕЛКОВ

Так как конформация белков поддерживается благодаря слабым связям, в условиях клетки они могут денатурировать, хотя и с меньшей скоростью, чем при высокой температуре. Самопроизвольная ренативация белков затруднена, так как из-за их высокой концентрации существует большая вероятность агрегации частично денатурированных молекул. В клетках имеются белки — молекулярные шапероны, которые обладают способностью связываться с частично денатурированными, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии белками и восстанавливать их нативную конформацию. Эти белки были обнаружены как белки теплового шока, так как их синтез усиливался при стрессовых воздействиях на клетку, например при повышении температуры.

Существует несколько семейств этих белков, они отличаются по молекулярной массе[7]. Например, известен белок hsp 70 – heatshock protein массой 70 kDa., представляющий собой высоко консервативный класс белков, находящийся во всех отделах клетки: цитоплазме, ядре, эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях. На карбоксильном конце единственной полипеп­тидной цепи Ш-70 имеется участок, который представляет собой бороздку, способный взаимодейст­вовать с пептидами длиной 7—9 аминокислотных остатков, обогащенных гидрофобными радикалами. Такие участки в глобулярных белках встречаются примерно через каждые 16 аминокислот.

Ш-70 способны защищать белки от температурной инактивации и восстанавливать конформацию и активность частично денатурированных белков. Белок, имеющий на своей поверхности фрагменты, обогащенные гидрофобными аминокислотными остатками, попадает в полость шаперонинового комплекса. В специфической среде этой полости в условиях изолированности от других молекул цитозоля клетки выбор возможных конформаций белка происходит до тех пор, пока не будет найдена энергетически наиболее выгодная конформация.

Такие белки есть во всех клетках организма. Они выполняют также функцию траспорта полипептидных цепей через биологические мембраны и участвуют в формировании третичной и четвертичной структур белковых молекул. Перечисленные функции белков стресса называются шаперонными. При различных видах стресса происходит индукция синтеза таких белков: при перегреве организма (40-44⁰С), при вирусных заболеваниях, отравлениях солями тяжелых металлов, этанолом и др.

Таким образом различные семейства шаперонов, обнаруженные практически во всех отделах клетки, участвуют в таких фундаментальных процессах, как:

a. ренативация частично денатурированных белков;

b. узнавание денатурированных белков и транспорт их в лизосомы;

c. синтез белков;

d. формирование трехмерной структуры белков;

e. сборка олигомерных белков;

f. транспорт белков через мембраны;

g. функционирование белковых комплексов и контроль за изменением между активной и неактивной конформацией.

РЕЗЮМЕ

Денатурация белков - это разрушение их нативной конформации, вызванное разрывом слабых связей, стабилизирующих пространственные структуры, при действии денатурирующих агентов. Денатурация сопровождается потерей биологической активности белка.

Уникальная трехмерная структура каждого белка разрушается, и все молекулы одного белка приобретают случайную конформацию, т.е. отличную от других таких же молекул.

Радикалы аминокислот, формирующие активный центр белка, оказываются пространственно удаленными друг от друга, т.е. разрушается специфический центр связывания белка с лигандом.

Гидрофобные радикалы, обычно находящиеся в гидрофобном ядре глобулярных белков, при денатурации оказываются на поверхности молекулы, тем самым создаются условия для агрегации белков. Агрегаты белков выпадают в осадок.

При денатурации белков не происходит разрушения их первичной структуры. Вспомните условия, в которых происходит гидролиз пептидных связей.

СПОСОБЫОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ

Делятся на две группы:

1) Способы осаждения нативного белка

2) Способы осаждения денатурированного белка

Чтобы осадить белок из раствора, надо лишить его обоих факторов стабилизации: и заряда, и гидратной оболочки.

ОСАЖДЕНИЕ НАТИВНЫХ БЕЛКОВ

Чтобы сохранить нативность белковой молекулы, ее заряд можно устранить только одним способом: приблизить рН среды к изоэлектрической точке белка (ИЭТ), а для большинства белков нашего организма ИЭТ находится в слабокислой среде. Другой фактор стабилизации - гидратную оболочку можно устранить разными способами.

Наиболее типичным примером осаждения нативного белка является ВЫСАЛИВАНИЕ.

а) ВЫСАЛИВАНИЕ - это осаждение белков высокими концентрациями нейтральных солей щелочных и щелочноземельных металлов, поскольку такие соли очень гидрофильны и обладают в высоких концентрациях водоотнимающими свойствами. Чаще это NaCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, CaCl₂. По мере добавления таких солей к раствору белка они сначала растворяюся в свободной воде, а затем, при дальнейшем повышении концентрации соли, конкурируют с белком за обладание водой, которая входит в состав гидратных оболочек. Белки менее гидрофильные, которые плохо удерживают воду гидратной оболочки, теряют ее раньше. Более гидрофильные белки требуют большей концентрации соли для высаливания. Поэтому с помощью высаливания можно разделить белки с разной степенью гидрофильности. Таким способом, например, можно разделить альбумины и глобулины плазмы крови.

При высаливании сохраняется нативность белковых молекул. Если осадить белки с помощью высаливания, а затем уменьшить концентрацию солей, например, методом диализа, то белок опять растворится.

Осаждения белков без потери ими нативности можно достичь также с помощью водоотнимающих средств.

б) ПРИМЕНЕНИЕ ВОДООТНИМАЮЩИХ СРЕДСТВ. Такими средствами являются растворители, которые смешиваются с водой в любых соотношениях. Чаще всего это ацетон, этиловый спирт. Эти вещества отнимают гидратные оболочки белков, и белки выпадают в осадок, если они лишены заряда. Но, в отличие от высаливания, осадок сразу (немедленно!) должен быть отделен от растворителя. Если растворитель и белок будут длительно находиться в контакте, то могут произойти необратимые изменения структуры белковой молекулы (денатурация).

ОСАЖДЕНИЕ ДЕНАТУРИРОВАННЫХ БЕЛКОВ

а) ДЕЙСТВИЕ СОЛЕЙ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ. Образуют соединения с SH-группами белков. Ядовиты для человека и животных. В медицинской практике применяются способы детоксикации при отравлениях тяжелыми металлами. В этих случаях для обезвреживания этих металлов дают внутрь молоко или другие белковые растворы.

б) КИПЯЧЕНИЕ (или просто нагревание до высоких температур) - усиливается тепловое движение молекул, ослабляются слабые типы связей, теряется нативность, белковая молекула “разворачивается”, гидрофобные структуры выходят наружу. Это приводит к потере гидратной оболочки, молекулы сближаются и взаимодействуют друг с другом. Это приводит к тому, что белок выпадает в осадок. При охлаждении нативность не восстанавливается.

При кипячении белок не всегда выпадает в осадок. Если нагревать белок в любой среде (сильно кислой, сильно щелочной или нейтральной средах), то денатурация белка происходит обязательно, белковые молекулы теряют гидратную оболочку. Но в сильно кислой или в сильно щелочной средах молекулы белка в осадок не выпадают, потому что у них остается один из факторов стабилизации - заряд. Сохранение заряда не позволяет молекулам белка сблизиться друг с другом - агрегация полипептидных цепей не происходит. Даже если раствор белка охладить - осадок все равно не выпадает - это будет коллоидный раствор денатурированного белка. Если приблизить затем рН среды к изоэлектрической точке белка (например, добавлением кислоты или щелочи), то белок выпадет в осадок, потому что будет лишен обоих факторов стабильности в растворе - и заряда, и гидратной оболочки.

[1] от англ. nature-природа

[2] Вспомните например свойства и функции сывороточного альбумина.

[3] С возрастом количество воды, удерживаемой белками уменьшается, как говорят белки “усыхают”. Это проявляется появлением складок и морщин например на коже у человека. Кроме того уменьшается функциональная активность многих белков.

[4] Это вовсе не обязательно, так как в клетке присутствуют и белки у которых pI находится в щелочной среде.

[5] Значение рН, при котором суммарный заряд белка равен нулю, называется изоэлектрической точкой и обозначается pI.

[6] Большая часть внутриклеточных белков, в особенности ферментов крайне чувствительны к температуре. Незначительное увеличение температуры на несколько градусов, сопровождается существенным изменением их функционального состояния и потерей активности.

[7] См. конспект: Фолдинг, образование надмолекулярных комплексов, агрегация белков