ЛЕКЦИЯ
Методы культивирования изолированных фрагментов растений основаны на исследовании такого важного свойства растительной клетки, как тотипотентность (свойство клетки реализовывать генетическую информацию, обеспечивающую ее дифференцировку и развитие до целого организма). В экспериментальных условиях при выращивании эксплантов возможна реализация супрессированной (подавленной) в естественных условиях тотипотентности под действием фитогормонов.
Следует отметить, что в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования.
Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная. Значительно реже культивируют клетки опухолей растений различного происхождения. Культуры опухолевых клеток независимо от способа культивирования на уровне морфологии мало отличаются от культур каллусных клеток. Значительным физиологическим отличием между ними является гормононезависимость опухолевых клеток, позволяющая им делиться и расти на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Однако опухолевые клетки лишены способности давать начало нормально организованным структурам. В некоторых случаях они способны образовывать тератомы (уродливые органоподобные структуры), нормальное развитие которых не происходит.
Каллусные клетки в пересадочной культуре могут спонтанно приобрести гормононезависимость. Природа такой независимости к ауксину и цитокинину, чаще всего применяемым при выращивании клеточных культур растений, может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих гормононезависимость клетки). При генетической гормононезависимости каллусные клетки ведут себя как опухолевые, при эпигенетической они теряют признак в ряду превращений клетка-растение-клетка.
Для получения культивируемых каллусных клеток in vitro фрагменты тканей разных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду в пробирки, колбы, чашки Петри. Процесс получения первичного каллуса и поддержание пересадочной культуры требует строго стерильных условий. Для этого с помощью стерильных растворов, содержащих хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты, стерилизуют экспланты, тщательно отмывая их затем от используемого раствора стерильной водой. Питательные среды, растворы, инструменты, материалы, необходимые для работы, стерилизуют в автоклавах или сухожаровых шкафах. Все манипуляции с культурами проводят в микробиологических боксах, облучаемых перед работой ультрафиолетом, или ламинар-боксах, где стерильность достигается постоянной подачей стерильного воздуха в рабочий объем.
Особенности дедифференцировки клеток экспланта и каллусогенеза зависят от эпигенетических характеристик составляющих его тканей. Клетки специализированных тканей, эксплантированных на питательную среду, содержащую минеральные соли, источники углерода, витамины и гормоноподобные вещества, должны дедифференцироваться, т.е. потерять структуры, характерные для их специфической функции в растении, и вернуться к состоянию делящейся клетки. Часто эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа и включает ткани, клетки которых различно дифференцированы. Различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причин гетерогенности культуры каллусной ткани, так как некоторые функциональные особенности исходных дифференцированных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации или эпигенетически наследуемые признаки.
В клетках экспланта, состоящего из неделящихся специализированных клеток, в самом начале культивирования могут наблюдаться изменения в метаболизме, вызываемые и травматическими синтезами, и дедифференцировкой, и подготовкой к процессу деления. Для разделения этих процессов можно применять прединкубацию эксплантов на среде без гормонов в течение нескольких суток (3-6). Это позволяет исключить не только изменения, связанные с травмой, но и возможное неконтролируемое влияние эндогенных гормонов эксплантата на изучаемые процессы.
В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех типов РНК, исчезают тканеспецифические белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и каллусной ткани. Это свидетельствует об изменении активности генов и белкового аппарата клеток при дедифференцировке.
Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4-6 недель (в зависимости от скорости роста клеток), переносится на свежую питательную среду (субкультивируется). Размер транспланта (переносимого кусочка) при культивировании на агаризованной питательной среде обычно составляет от 60 до 100 мг массы ткани на 30-40 мл питательной среды.
Таким образом, техника культивирования тканей растений позволяет получить длительную пересадочную каллусную культуру из любых живых тканевых клеток интактного растения. Клетки различно дифференцированные (в том числе и меристематические) переходят in vitro к сложному процессу дедифференциации, теряют присущую им структурную организацию и специфические функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус.
В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями.
При культивировании растительных клеток и при выращивании культуры тканей применяются среды Мурасиге-Скуга, Нагата-Такебе, Хеллера, Нича-Нича, Кнудсона и другие в различных модификациях.
Основными компонентами питательных сред для культуры клеток и тканей растений являются минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углеродного питания (обычно сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста. Иногда в состав питательных сред включают комплексные органические добавки (гидролизат казеина или смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, экстракты из разных органов растения).
Поверхностное культивирование
Культура каллусных тканей выращивается поверхностным способом на полужидкой агаризованной среде (концентрация агара – 0,6-1%), среде с применением других желирующих полимеров либо на мостиках из фильтровальной бумаги или дисках из пенополиуретана, погруженных в жидкую питательную среду.
Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным - пигментированным полностью или зонально.
В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают: 1) рыхлыми, сильно обводненными, легко распадающимися на отдельные клетки, 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами, 3) плотными с зонами редуцированного камбия и сосудов.
Как правило, в длительной пересадочной культуре, на средах, включающих ауксины, особенно синтетический аналог ауксина 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми.
В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный для клетки растений онтогенез: они приступают к росту растяжением, затем дифференцируются как зрелые каллусные клетки и наконец деградируют.
Каллусные клетки, выращиваемые поверхностным способом, часто применяют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий, мутантов, для регенерации растений, из них также получают суспензии клеток, культивируемых в жидкой питательной среде.
Суспензионное культивирование
Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными культурами. Термин этот не является строго научным и очень точным, так как не объясняет основной особенности поведения клеток при таком выращивании.
Получено еще сравнительно мало культур клеток высших растений, по своим параметрам полностью удовлетворяющих требованиям суспензионного (глубинного) культивирования. В значительной мере это объясняется трудностями получения культуры клеток, состоящей преимущественно из отдельных клеток или небольших их агрегатов. Представляется целесообразным поэтому сначала рассмотреть методы получения клеточной суспензии, а также обсудить само понятие суспензионной (глубинной) культуры применительно к растительным клеткам.
Безусловно, выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных клеток поверхностным способом. Здесь легче и более воспроизводимо влиять на метаболизм и рост клеточных популяций экзогенными факторами. Суспензионные культуры удобнее для проведения биохимических и молекулярно-биологических экспериментов – изучения индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии и репрессии определенных генов, изолирования и характеристик мутантов.
Суспензионную культуру можно получить из фрагментов органа растения (диски запасающей паренхимы мясистых корней моркови, петрушки, клубней картофеля и др.), однако этот путь более трудоемкий и требует большего времени. Клетки экспланта должны при этом образовывать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жидкую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии.
Обычно для получения культуры клеток используется культура каллусной ткани. Рыхлые обводненные культуры каллусных тканей более пригодны для перевода в суспензию, чем структурированные плотные каллусы. Оптимальными подходами для получения суспензии являются выращивание каллусов на среде с 2,4-Д, исключение из среды ионов кальция, обработка пектиназой транспланта, предназначенного для выращивания в суспензионной культуре. Для получения культуры клеток берется наиболее жизнеспособная (пролифелирующая) часть каллусной ткани, а ее количество должно быть в 15-20 раз больше в расчете на объем питательной среды, чем при серийном культивировании на агаре. При этом может использоваться питательная среда того же состава, что и для поверхностного культивирования, но в некоторых случаях увеличивают количество ауксинов и (или) уменьшают количество цитокининов. Режим перемешивания и аэрации при инициации культуры клеток обычно такой же, как и при дальнейших серийных субкультивированиях культур клеток на роллерах и качалках (круговая качалка – 10-12 оборотов/минуту).
Образование первичной суспензии растительных клеток можно считать результатом трех процессов: 1) распадение каллусной ткани на клетки и небольшие клеточные агрегаты в момент внесения в жидкую питательную среду; 2) отделение клеток и клеточных агрегатов с поверхности кусочков ткани в течение первых субкультивирований; 3) деления и роста клеток, образовавшихся по первым двум способам, и распадения разрастающихся клеточных агрегатов на более мелкие агрегаты и клетки. Последний процесс является типичным для роста стабилизировавшейся перевиваемой культуры клеток высших растений.
Первичную суспензию перед субкультивированием либо в специальном цилиндре разделяют на фракции по скорости седиментации (используют вехнюю фракцию) либо фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных плотных кусков каллусной ткани, остатков экспланта и очень крупных агрегатов.
Фильтрование рекомендуется и в нескольких последующих субкультивированиях до приобретения клеточной суспензией желательных характеристик. Однако агрегированность суспензии зависит не только от характеристик начальной линии, но и от условий культивирования.
Для глубинного культивирования растительных клеток применяются способы, разработанные для микробиологических целей. Используются закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. Хотя, при глубинном выращивании растительных клеток принцип турбидостата практически не применяется. Одной из причин этого является разрушения части клеток при отводе их к оптическому прибору. Выращивание суспензии клеток растений в установках непрерывного культивирования по принципу хемостата применяется как для изучения метаболизма клеток, стабильно поддерживающихся в разных фазах клеточного цикла, так и при промышленном выращивании клеточной биомассы с целью получения экономически важных продуктов.
Однако до настоящего времени наиболее изученным и распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий является закрытая периодическая система. В этом случае для аэрации и перемешивания суспензии используют роллеры, качалки (обычно круговые), ферментеры с механическими и магнитными мешалками или ферментеры барботажного типа, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком.
Перед использованием подбирают рН инкубационного буфера, концентрацию красителя, время инкубации, строят калибровочные кривые для смеси живых и убитых клеток.
Критериями роста в цикле выращивания служит увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы. Модельная ростовая кривая имеет типичную S-образную форму (рисунок 1).На ней различают:
Рис. 1. Фазы кривой роста популяции растительных клеток:
I – лаг-фаза, II – экспоненциальная фаза, III – фаза линейного роста, IV – фаза замедленного роста, V – стационарная фаза, VI – фаза отмирания.
1) латентную (лаг) фазу, в которой видимый рост инокулята не наблюдается ни по одному из критериев. При этом наблюдается высокая интенсивность дыхания, максимальные значения энергетического уровня, интенсивный синтез ДНК, РНК, белков и других компонентов клетки, но низкий митотический уровень. Длительность периода адаптации зависит от количества и физиологического состояния инокулята и условий культивирования;
2) экспоненциальную фазу, характеризующуюся ростом с максимальной скоростью, максимальными величинами митотической активности, а также преобладанием мелких клеток меристематического типа;
3) линейную, в течение которой скорость роста постоянна;
4) фазу замедленного роста, связанного с субстратным лимитированием и ингибированием продуктами обмена, и характеризующуюся несбалансированным ростом популяции по основным критериям, снижением уровня дыхания, переходом части клеток в дифференцированное состояние, увеличением доли крупных вакуолизированных клеток. Увеличением синтеза вторичных метаболитов (сердечных гликозидов, антрахинона, диосгенина);
5) стационарную фазу, характеризующуюся еще малой скоростью деградации клеток, которая уравновешивается делением клеток, высокими биосинтетическими и биотрансформирующими потенциями жизнеспособных дифференцированных клеток, низким уровнем дыхания и появлением чрезвычайно крупных вакуолизированных клеток;
6) фазу деградации клеток с удельной скоростью роста, принимающей отрицательное значение.
Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться продолжительностью фаз от модельной. Процессы ростового цикла зависят от вида растения, количества внесенного материала и условий культивирования (состав питательной среды, температура, начальное значение рН, состав газовой фазы, скорость перемешивания). Первичный и вторичный метаболизм культивируемых клеток растений видоспецифичен, зависит от типа дифференцировки исходных клеток растения и регулируется условиями выращивания. Генетическая изменчивость клеток как следствие их культивирования вне организма, исчезновение одних и появление других стойких признаков, передающихся в ряду клеточных поколений, приводит к возникновению из первичной каллусной ткани генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Это позволяет отобрать или создать экспериментально линии, сохраняющие биосинтетические системы, характерные для исходного растения, и линии, синтезирующие принципиально новые вещества.
Морфологические характеристики культуры, полученной суспензионным культивированием:
- высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе);
- морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);
- отсутствие трахеидоподобных элементов.
Рост суспензионных культур клеток можно оценивать по одному или нескольким следующим параметрам:
1. Объем осажденных клеток (ООК). ООК - величина, которую составляет отношение объема осадка клеток после центрифугирования в течение 5 минут при 200 g к объему суспензии, обычно в %.
2. Число клеток. Для определения количества клеток суспензию диспергируют до одноклеточного состояния обработкой 5-10% хромовой кислотой и проводят подсчет клеток в 1 мл клеточной суспензии, нанесенной на сетку счетной камеры Фукса-Розенталя.
3. Сырая и сухая масса. Суспензия клеток фильтруется под слабым вакуумом через смоченный и взвешенный нейлоновый фильтр, вложенный в воронку Бюхнера. Клетки промывают дистиллированной водой для удаления остатков питательной среды, оттягивают воду под вакуумом и взвешивают снова вместе с фильтром. Сухая масса – определяется аналогично, но взвешивается сухой фильтр, а клетки сушат обычно в течение суток вместе с фильтром в термостате при 60 оС до постоянной массы.
4. Содержание белка. Для определения белка клетки собирают на фильтре из стекловолокна, дважды промывают кипящим раствором 70% этанола, сушат ацетоном, гидролизуют 1М NaOH при температуре 85 оС полтора часа. Затем фильтруют и определяют белок.
5. Проводимость среды. Определяют с помощью кондуктометра. Как правило, она обратно пропорциональна свежей массе клеток.
6. Жизнеспособность клеток. Выражается отношением количества жизнеспособных клеток к общему их количеству в 1 мл суспензии. Оценивают, изучая движение цитоплазмы под микроскопом, а также с помощью прижизненных красителей (0,01% р-р флюоресцеиндиацетата, 0,5% р-р синий Эванса).
Суспензионные культуры наиболее часто используют для промышленного получения вторичных метаболитов. Вещества, продуцируемые растительными клетками, применяются в медицине, парфюмерной промышленности, растениеводстве и других отраслях промышленности. К ним относятся: алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, эфирные масла, пигменты, антиканцерогены (птотецин, харрингтонин), пептиды (ингибиторы фитовирусов).
Культивирование отдельных клеток
Источником отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспензии в жидкой питательной среде, мацерация тканей растений, изолированные протопласты после восстановления ими клеточной стенки. Причем, изолированные протопласты являются идеальными отдельными клетками.
Культивирование отдельных клеток позволяет получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость при выращивании клонового материала. Отдельные клетки важны для клоновой селекции мутантных, гибридных, трансформированных линий. Обычно в эти клетки вводят маркерные гены или создают маркерные признаки для обеспечения селективных условий отбора.
Мацерированные клетки ткани растения являются хорошей моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и отдельной клетке. Вместе с тем при культивировании этих клеток на среде, стимулирующей деление клеток, они дифференцируются и образуют колонии каллусных клеток. Для получения отдельных мацерированных клеток используются специальные мацерирующие ферментативные препараты, содержащие мацеразу (полигалактуроназу), пектиназу, поливинилпирролидон, сульфат калия, сорбит (маннит), 2-N-морфолино-этансульфоновую кислоту. Данная процедура производится в ламинар-боксе в условиях строгой стерильности.
Отдельные клетки также могут быть получены из суспензий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлюориметра или путем последовательных разбавлений. В этом случае суспензии готовятся разными способами: 1) 1-2 мл суспензии отбирают из супернатанта после оседания основной массы клеток, 2) суспензию фильтруют через фильтры с уменьшающимся диаметром пор. Для последовательных разведений используют платы для микротитрований, что позволяет микроскопически контролировать клеточный состав при последовательных разведениях.
Индукция делений отдельных клеток возможна при применении очень богатой питательной среды, причем объем среды должен быть минимальным. Однако даже при соблюдении всех этих условий процент разделившихся клеток остается очень низким. Более эффективны методы "кормящего слоя" или "ткани-няньки". Для создания "кормящего слоя" берут суспензию клеток того же вида растения. Клеточная суспензия должна находиться в ранней стадии ростового цикла. Каллусная культура, служащая "тканью-нянькой", также должна быть в стадии активного роста. При достижении колонией, выросшей из отдельной клетки, размера 0,5-1 мм, она может быть перенесена для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно либо на фильтр, помещенный на поверхность питательного агара. Использование "кормящего слоя", "ткани-няньки" или минимального объема среды, в которую помещается отдельная клетка, связаны с явлением, называемым "действие фактора кондиционирования". Несмотря на многочисленные попытки определить природу веществ, индуцирующих деление отдельной клетки, и механизм действия фактора кондиционирования, данный вопрос окончательно не решен.
Изучение механизма взаимодействия клеток при размножении их в популяции - важная научная проблема, которая решается на уровне культивирования отдельных клеток.
На первом этапе необходимо выделить неповрежденную и жизнеспособную клетку из ткани целого растения или каллусной ткани.
Этого возможно достичь разными путями:
1. Отдельные клетки можно получать из ткани целого растения путем ее мацерации. Для получения отдельных мацерированных клеток используются специальные мацерирующие ферментные препараты, содержащие пектолитические ферменты, поливинилпирролидон, сульфат калия, сорбит (маннит), 2-N-морфолино-этансульфоновую кислоту. Данная процедура производится в условиях строгой стерильности.
Мацерированные клетки ткани растения являются хорошей моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и отдельной клетке. Однако процесс мацерации может привести к утрате способности отдельных клеток к последующим делениям.
2. Удобнее получать отдельные клетки из суспензионных культур с использованием микроманипулятора, проточного цитофлюориметра или путем последовательных разбавлений. В этом случае суспензии готовятся разными способами: 1) либо 1-2 мл суспензии отбирают из супернатанта после оседания основной массы клеток, 2) либо суспензию фильтруют через фильтры с уменьшающимся диаметром пор.
Для последовательных разведений используют платы для микротитрований, что позволяет микроскопически контролировать клеточный состав при последовательных разведениях.
Получение одиночных клеток на основе суспензионных культур связано с меньшим риском повреждения по сравнению с выделением непосредственно из тканей растения.
3. Отдельные клетки могут быть получены из рыхлых каллусов при помощи микроманипуляторов.
4. Идеальными отдельными клетками являются протопласты, образовавшие клеточную стенку.
При первых же попытках культивирования отдельных клеток стало ясно, что они ведут себя иначе, чем их скопления в виде агрегатов в суспензии или каллусной массы на поверхности питательной среды.
Возникла важная научная проблема: как заставить делиться клетки, изолированные от влияния других клеток популяции или тканей.
Было предложено несколько вариантов культивирования отдельных клеток.
Впервые подобрать условия, подходящие для деления отдельных клеток, удалось в 1954 году Мьюиру, Хильденбрандту и Райкеру. Этот способ получил название метода «ткани – няньки».
При этом клетку изолируют из рыхлого каллуса непосредственно на кусочек фильтра, помещенный за 2-3 дня до изолирования на верхушку каллусной ткани, из которой была взята клетка. В качестве «няньки» можно также использовать каллусную ткань другого растения родственного вида. В любом случае каллус должен находиться в фазе активного роста. Только тогда клетки способны расти и делиться.
По мере старения каллуса-няньки фильтр с клетками переносится на молодой каллус. При достижении колонией, выросшей из отдельной клетки, размера 0,5-1 мм, она может быть перенесена для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно либо на фильтр, помещенный на поверхность питательного агара.
Метод «ткани-няньки»
Другой вариант культивирования одиночных клеток на основе метаболитов делящихся клеток – методкондиционирования среды. В этом случае используют культуральную жидкость длительно выращиваемой суспензионной культуры. При этом клеточную суспензию для удаления клеток фильтруют через бактериальный фильтр, после чего фильтрат (среду с метаболитами) добавляют в среду для культивирования одиночных клеток.
Можно также использовать метод «кормящего слоя». Для этого в качестве кормящего одиночные клетки слоя берут суспензию клеток того же вида, что и одиночная клетка, или близкого вида. Клеточная суспензия должна находиться в ранней экспоненциальной фазе ростового цикла.
Рис. Использование «кормящего слоя» (суспензионная культура) при выращивании колоний из одиночных клеток: 1 - колба, 2 - колония, возникшая из отдельной клетки, 3 - фильтровальная бумага, 4 - металлическая сетка, 5 - суспензия клеток «кормящего слоя», 6 - подложка (пенополиуретан), 7 - питательная среда.
Метод плейтинга был разработан для массового культивирования отдельных изолированных клеток. В 1959 г. Бергман предложил фильтровать суспензионную культуру (в его экспериментах это были табак и фасоль) стерильно через один слой батиста (ячейки 0,3х0,1 мм). В результате получали суспензию, на 90% состоящую из отдельных клеток. Эту суспензию смешивали с питательной средой того же состава, что использовался при культивировании суспензии (среда содержала 0,6% агара). Смесь разливали тонким слоем (1 мм) в чашки Петри. Агар разделял клетки, но не препятствовал обмену химическими сигналами между ними, а толщина слоя позволяла наблюдать за их поведением под микроскопом.
Метод микрокультуры (микрокапель) базируется на использовании очень малых объемов очень богатой питательной среды, например, среды Као-Михайлюк. При этом объем среды, в которую помещаются клетки, должен был минимальным (микрокапли объемом до 20 мкл). Однако даже при соблюдении всех этих условий процент разделившихся клеток остается низким. Метод предложил академик Ю.Ю. Глеба. В микрокапле удобно наблюдать за получением и делением клеток при соматической гибридизации.
Метод микрокамеры был разработан Джонсом в 1960 г., и может быть использован при оптимальной сбалансированности состава питательной среды для культивирования отдельной клетки.
Метод включает следующие процедуры:
на предметное стекло с помощью жидкого парафина на небольшом расстоянии наклеивают покровные стекла;
между которыми наносят квадрат из жидкого парафина; в камеру из парафина помещают каплю питательной среды с отдельной клеткой; сверху камеру накрывают еще одним покровным стеклом; за развитием клеточной колонии наблюдают под микроскопом.
Использование микрокамеры Джонса позволило Вэсилу и Хильдебрандту в 1965 г. продемонстрировать возможность получения из изолированной клетки табака нормально развивающегося и достигшего цветения растения. Таким образом, впервые экспериментально была доказана тотипотентность клетки растения.
Сложности культивирования отдельных клеток способствовали возникновению гипотезы о «факторе кондиционирования». Так было названо вещество или вещества, стимулирующие деление отдельных клеток. По-видимому, «фактор кондиционирования» вырабатывается самими клетками, но в небольшом количестве. И только увеличивая число клеток, вырабатывающих этот фактор, или же уменьшая объем среды, в котором выращивается клетка, можно заставить ее делиться.
Было выяснено, что фактор кондиционирования имеет химическую природу, термолабилен, водорастворим, низкомолекулярен, видонеспецифичен, не заменяет известные фитогормоны. Однако, несмотря на многочисленные попытки определить природу веществ, индуцирующих деление отдельной клетки, и механизм действия фактора кондиционирования, данный вопрос окончательно не выяснен.