Изучение иммунохимических реакций
Комплекс «антиген – антитело» образуется при взаимодействии чужеродных для нашего организма веществ с защитными белками сыворотки крови (антителами). Поэтому такие реакции называют также серологическими (serum – сыворотка).
Существуют два вида постановки иммунохимических реакций, используемых в диагностике:
1. Для выявления количества или титра антител в сыворотке крови с помощью известного антигена (серодиагностика). В качестве стандартного антигена применяется диагностикум.
2. Для обнаружения и идентификации антигенов в биологических жидкостях при помощи известных антител (серотипирование). В качестве препарата, содержащего антитела используются диагностические сыворотки.
Общие закономерности иммунологических методов:
· исследование проводится in vitro;
· проявляется при иммунологическом соответствии (гомологичности) антигена и антитела;
· протекают в две фазы (невидимая и видимая).
Для количественной характеристики иммунологических методов исследования используют такие понятия, как чувствительность и специфичность.
Чувствительность = число положительных реакций у истинных больных * 100%
Число обследованных больных с подтвержденным диагнозом
Специфичность = число отрицательных реакций в контрольной группе * 100%
Число обследованных в контрольной группе
Все иммунологические методы можно разделить на три группы:
1). Основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.)
2). Основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой агглютинации, коагглютинации, латекс – агглютинации, угольной агломерации, связывания комплемента и др.)
3). С использованием меченых антител или антигенов (флюоресцирующих антител, иммуноферментного, радиоиммунного анализа и других методов).
II. Агглютинационные тесты.
Реакция агглютинации (РА) основана на взаимодействии поверхностных антигенов бактерий и других корпускулярных частиц с антителами и протекает в две фазы:
1. специфическая фаза – связывание детерминантной группы (эпитопа) антигена с паратопом – активным центром иммуноглобулина (невидимая фаза).
2. неспецифическая (видимая фаза) – образующийся комплекс (АГ+АТ) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев. Однако это явление возможно лишь в электролитной среде – 0,85% раствора натрия хлорида.
Реакцию агглютинации можно применять для обнаружения специфических антител в сыворотке крови или при помощи стандартной агглютинирующей сыворотки можно идентифицировать выделенные микроорганизмы.
Развернутая реакция агглютинации для выявления специфических антител в сыворотке крови больного ставится в пробирках или лунках полистироловых планшетов. У больного (до приема пищи) берется кровь из вены в чистую пробирку, и выдерживается комнатной температуре около часа. Стеклянной палочкой образовавшийся сгусток крови отделяется от желтоватой жидкости – сыворотки, которую отсасывают в стерильную пробирку и хранят при температуре 4ºС до использования.
Во все пробирки (7 штук) наливают по 0,5 мл физиологического раствора. В первую пробирку вносят 0,5 мл сыворотки – получается сыворотка разведением 1: 2. Отсюда 0,5 мл смеси переносят во вторую пробирку – получается сыворотка разведением 1: 4, и т.д. Из последней пробирки 0,5 мл смеси удаляют в дезинфицирующий раствор. Затем во все пробирки вносят по 1 капле диагностикума (взвесь убитых или живых бактерий), встряхивают и оставляют при комнатной температуре или инкубируют при 37ºС на 18 – 20 часов. Обязательные контроли – сыворотка без диагностикума и диагностикум без сыворотки.
При положительном результате реакции на дне пробирки виден осадок в виде «перевернутого зонтика», а при отрицательном – осадок в виде «пуговицы».
Ориентировочная реакция агглютинации служит для предварительного определения вида микроба. На стекло наносят каплю узкоспецифичной адсорбированной сыворотки (содержащей только специфические антитела). Сыворотку наносят в разведении 1: 100 и рядом – каплю физиологического раствора (контроль). Исследуемую культуру микроба петлей вносят в обе капли и размешивают. Через 2 - 4 минуты учитывают результат. При положительной реакции (соответствии исследуемой культуры диагностической сыворотке) наблюдается скучивание бактерий в виде хлопьев на фоне прозрачной жидкости. В контроле – равномерная муть. Реакцию ставят перед постановкой развернутой РА для идентификации микроба.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) заключается в том, что молекулы антигена адсорбируются на поверхности эритроцитов. Такие «нагруженные» антигенами эритроциты приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для данного антигена. Эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне пробирки гемагглютинат в виде перевернутого зонтика.
Реакция преципитации. В ней участвуют мелкодисперсные антигены (преципитиногены), которые связываются с соответствующими антителами (преципитинами). Чаще всего эту реакцию применяют для выявления антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела – преципитины. Это качественный метод исследования. В узкую преципитационную пробирку добавляют стандартную иммунную сыворотку и на нее осторожно наслаивают жидкость, содержащую определяемый антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца (преципитина) свидетельствует о наличии антигена (например, возбудителя сибирской язвы в реакции Асколи) в исследуемой жидкости. Преципитат возникает вследствие укрупнения коллоидных частиц антигена. Иногда эту реакцию называют кольцепреципитацией. Важным условием образования нерастворимого комплекса антиген – антитело является:
1. полная прозрачность жидкостей,
2. эквивалентное соотношение ингредиентов, так как образующийся комплекс растворяется в избытке антигена или антитела.