Основные тенденции ферментативных процессов в биотехнологии
Введение
Истоки современной биотехнологии уходят глубоко в прошлое. С незапамятных времен получали пищевые продукты и улучшали их качество с использованием биологических процессов и агентов. В качестве биологических агентов применялись различные организмы (от животных до микроорганизмов). На этом принципе основаны общеизвестные древнейшие способы получения молока, изготовления вин, уксуса, пивоварения, сыроделия, хлебопечения и т. д.
Хотя история пищевых технологий насчитывает тысячелетия, тем не менее совершенствование их постоянно продолжается. В последнее время наметились перспективы принципиального сдвига в технологии получения и улучшения качества пищевых продуктов. Это связано с переходом от использования целых биологических организмов на клеточный и молекулярный уровни. Появилась возможность конструировать биологические агенты, изменять структуру молекул, «резать» их на части и соединять по усмотрению исследователя-биотехнолога, извлекать биокатализаторы из естественного клеточного окружения и присоединять с помощью ковалентных или других связей к специальным носителям (тем самым опять-таки изменять структуру молекул) и т.д. В этом и заключается главное и принципиальное отличие традиционных пищевых технологий и их традиционного научного фундамента от современной биотехнологии. Следует, впрочем, иметь в виду, что четкую грань между технической биохимией и биотехнологией провести достаточно трудно.
Может возникнуть вопрос, почему в разделе, посвященном промышленным процессам инженерной энзимологии, речь идет в основном о получении пищевых продуктов. Дело в том, что иммобилизованные ферменты и клетки в основном используют в получении пищевых продуктов и в меньшей степени фармацевтических препаратов. Такое ограничение вызвано весьма малой доступностью (в широких масштабах) ферментов, способных катализировать реакции технологической значимости, например, в органической или неорганической химии, нефтехимии, полимерной химии, фармацевтической промышленности и т. д. Напротив, традиционное использование растворимых ферментов в пищевой промышленности создало определенный фундамент для дальнейшего совершенствования методов в этой области.
Биотехнология ферментов
Ферменты (энзимы) (от лат. fermentum - закваска) - это белки, выполняющие роль катализаторов в живых организмах. Основные функции ферментов - ускорять превращение веществ, поступающих в организм и образующихся при метаболизме (для обновления клеточных структур, для обеспечения его энергией и др.), а также регулировать биохимические процессы (напр., реализацию генетической информации), в т.ч. в ответ на изменяющиеся условия.
Выделяют 6 основных классов ферментов:
I класс – Оксидоредуктазы
II класс – Трансферазы
III класс – Гидролазы
IV класс – Лиазы
V класс – Изомеразы
VI класс – Лигазы
Достоинства ферментов по сравнению с неорганическими катализаторами:
· нетоксичность,
· работают в мягких условиях, не требующих высоких температур и, следовательно, затрат топлива,
· используют доступное сырье (часто отходы), что выгодно с экономической и экологической точек зрения.
Ферменты по объёму производства занимают 3 место после аминокислот и антибиотиков.
Известно и охарактеризовано примерно 2000 ферментов по данным энзимологии. В промышленности используется всего около 30 ферментов. Из производимых ферментов чаще всего используются (и продаются) гидролазы – щелочные и нейтральные протеазы (60%). Они в основном используюся в качестве детергентов при производстве синтетических моющих средств. На втором месте - гликозидазы (30%). Они используются в производстве кондитерских изделий, фруктовых и овощных соков. Основное место среди них занимают глюкоизомераза и глюкозамилаза, применяющиеся при обогащении фруктозой кукурузных сиропов и составляющие около 50% рынка пищевых ферментных препаратов.
Ферменты применяются также в текстильной, кожевенной, целлюлозно-бумажной, медицинской, химической промышленности.
Применение ферментов в технологических процессах:
- амилаза – гидролиз крахмала до декстринов, мальтозы и глюкозы в спиртовой и пивоваренной промышленности, хлебопечении, получении патоки, глюкозы,
- липазы – гидролиз жиров и масел в пищевой, медицинской промышленности, сельском, жилищно-коммунальном хозяйстве, бытовой химии,
- пектиназа – гидролиз галактуронана, осветление вина и фруктовых соков,
- глюкоизомераза – изомеризация глюкозы во фруктозу в кондитерской, ликероводочной, безалкогольной промышленности, хлебопечении. Фруктоза является более сладким моносахаридом, чем глюкоза.
- пептидогидролаза – лизиса (гидролиза) белков в получении аминокислот, производство и получение сыра, мягчение мясных и рыбных изделий, выделка кож, активизация пищеварения. В пивоваренной, винодельческой, пищевой промышленности, в сельском хозяйстве, медицине.
- целлюлазы – гидролиз целлюлозы до глюкозы. Производство пищевых и кормовых препаратов, этанола, глюкозо-фруктозных сиропов. Спиртовая, пивоваренная, пищеконцентратнная промышленность. Хлебопечение, коромопроизводство.
- фруктофуранозилаза – инверсия сахарозы. Кондитерская, ликероводочная, безалкогольная промышленность, производство сиропов.
Получение ферментов
Традиционные источники ферментов – это природные объекты, в которых содержание фермента составляет не менее 1%.
Без применения биотехнологии для получения ферментов в больших количествах пригодны только некоторые растительные организмы на определенной фазе их развития: например, проросшее зерно различных злаков и бобовых, латекс и сок зеленой массы некоторых растений, а также ткани и органы животных: сычуг крупного рогатого скота, семенники половозрелых животных.
Зато практически неограниченный источник ферментов – это микроорганизмы и грибки. За счёт размножения они самостоятельно наращивают объёмы производства ферментов.
В настоящее время наиболее прогрессивным является метод культивирования микроорганизмов при непрерывной подаче в ферментер как питательной среды, так и посевного (микробного) материала.
Иммобилизованные ферменты
Иммобилизированные ферменты (от лат. immobiiis — неподвижный) - это препараты ферментов, молекулы которых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), и сохраняют при этом полностью или частично свои каталитические свойства. Иммобилизованные ферменты обычно не растворимы в воде; между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитической реакции, ингибиторов и активаторов.
Существует несколько основных способов иммобилизации ферментов.
Способы иммобилизации ферментов:
1) путем образования ковалентных связей между ферментом и матрицей;
2) полимеризацией мономера, образующего матрицу, в присутствии фермента, который при этом оказывается включенным в сетку полимера - обычно геля;
3) благодаря электростатическому взаимодействию противоположно заряженных групп фермента и матрицы;
4) сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу;
5) связыванием фермента и матрицы в результате невалентных взаимодействий - гидрофобных, с образованием водородных связей и др.;
6) инкапсулированием - созданием около молекул фермента полупроницаемой капсулы, например, включением фермента в липосомы;
7) сшиванием молекул фермента между собой, например, глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром диимида адипиновой кислоты.
Особый случай иммобилизации - проведение ферментативных реакций в двухфазной системе, когда фермент находится в водной фазе, а субстраты и продукты реакции распределяются между органической и водной фазами, что позволяет в зависимости от коэффициента распределения веществ между фазами сдвигать равновесие реакции в нужную сторону; диспергирование фаз увеличивает поверхность их раздела и тем самым улучшает доступ субстрата к ферменту.
Среди способов иммобилизации наибольшее распространение получили ковалентное связывание фермента с матрицей и включение фермента в гель. В первом случае в качестве матрицы обычно используют целлюлозу, декстрановые гели (сефароэу, агарозу), микропористые стекла или кремнеземы, а также синтетические полимеры. Матрицу при ковалентной иммобилизации ферментов обычно предварительно активируют, обрабатывая, например, бромцианом, азотистой кислотой или цианурхлоридом. Благодаря этому она становится носителем активных группировок, которые способны вступать в реакцию сочетания, взаимодействуя с группами NH2, ОН, СООН. Во втором случае в качестве гелеобразующего полимера используют полиакриламид. На практике иммобилизация часто осуществляется одновременно несколькими способами.
Конкретные примеры использования иммобилизированных ферментов: производство фруктозы из глюкозных сиропов.