Системы культивирования микроорганизмов
При глубинном выращивании объектов их культуры могут находиться в периодических, или "закрытых", и хемостатных (непрерывных) - "открытых" системах.
Закрытой называют такую систему (культуру), когда хотя бы один из компонентов питательной среды или она вся не может ни поступать в систему, ни покидать её. В такой системе скорость роста организмов должна после ускорения стремиться к нулю из-за недостатка субстрата или из-за гибели клеток вследствие накопления продуктов метаболизма. Следовательно, периодические культуры находятся в неустойчивом состоянии.
Открытая (хемостатная) система - это система, когда все питательные компоненты могут поступать в реактор, в котором выращивается тот или иной биообъект, и удаляться из реактора в виде продуктов синтеза (антибиотики, витамины, ферменты и т.д.) или биомассы самих объектов.
Периодическое культивирование микроорганизмов
В периодическом состоянии динамика роста и размножения микроорганизмов в жидкой питательной среде обладает рядом особенностей, общих для бактерий, актиномицетов, микроскопических грибов, микоплазм и других про- и эукариот. При индивидуальном развитии им свойственна высокая скорость размножения. Развитие происходит в виде последовательных фаз, характер и продолжительность которых зависят от физиологического состояния клеток, определяемого в свою очередь условиями разнообразных факторов среды, в которой развиваются популяция того или иного организма.
Другими словами, фазы роста микроорганизма, гриба отражают количественные и качественные изменения в их биомассе и окружающей среде.
В простой гомогенной периодической культуре выделяют от 4 до 8, и даже до 16 фаз.
1. Исходная фаза (лаг-фаза или индукционный период) является фазой задержки роста, когда размножения клеток не происходит. Эта фаза характеризуется отсутствием роста клеток. В этот период посевная культура приспосабливается к изменившимся внешним условиям и вырабатывает ферменты, необходимые для роста на данной питательной среде. В лаг-фазе в клетках культуры происходят значительные качественные изменения: возрастет количество нуклеиновых кислот, в первую очередь РНК, активизируются одни ферменты и синтезируются другие.
2. Период положительного ускорения роста зависит от температуры, состава питательной среды, качества посевного материала. Многие авторы эти две фазы рассматривают вместе. Число клеток остаётся постоянным из-за отсутствия в этот период клеточного деления. Общее состояние характеризуется как состояние приспособления к питательной среде. В этот период усиливается синтез веществ, клеток, они увеличиваются в размере, в них образуется большое количество индуцибельных ферментов.
3. Фаза логарифмического (лог-фаза) или экспоненциального (показательного) роста. Она характеризуется постоянной и максимальной скоростью роста клеток.
4. Фаза отрицательного ускорения. В эту фазу скорость размножения замедляется, а время генерации увеличивается. Наступление этой фазы обусловлено истощением питательной среды и накоплением в культуральной жидкости токсических веществ, которые начинают ингибировать развитие культуры. Кроме того, в эту фазу происходит наивысшее накопление массы в единице объёма.
5. Стационарная фаза роста, или максимума. В эту фазу скорость размножения и отмирания клеток одинаковая. Концентрация живых клеток в эту фазу достигает максимума, и она называется М-концентрацией. В этой фазе сама биомасса и продукты биосинтеза обладают наибольшей биотехнологической ценностью.
6. Фаза отмирания. Причинами отмирания являются истощение среды и накопление в ней большого количества токсических продуктов метаболизма. В период стадии отмирания общее количество биомассы уменьшается, что чаще всего происходит за счет аутолиза.
Хемостатная культура, или метод непрерывного культивирования представляет собой прочную культуру тех или иных биообъектов. В таком случае возможность продления жизни популяции, штамма поддерживается с помощью непрерывной подачи свежей среды и постоянного отбора биомассы или образовавшихся продуктов метаболизма, т.е. можно культуру как бы зафиксировать в одной, например стационарной, фазе роста и получать нужные продукты обмена или биомассу во времени столько, сколько требуется.
Концентрирование и высушивание биопрепаратов
В культуральной жидкости после окончания процесса ферментации содержатся культивируемые объекты, продукты их жизнедеятельности, остатки питательной среды, растворимые и нерастворимые вещества. Целевым продуктом биосинтеза могут быть непосредственно сами объекты, либо их метаболиты, растворенные в культуральной жидкости или находящиеся внутри клеток.
Почти во всех случаях для получения целевого продукта необходимо отделить взвешенную фазу от культуральной жидкости.
Культуральные жидкости обычно являются сложными смесями и содержат большое число компонентов, многие из которых обладают близкими физико-химическими свойствами. Наряду с растворенными минеральными солями, углеводами, белками и другими органическими веществами культуральные жидкости содержат в значительном количестве полидисперсные коллоидные частицы и взвеси. Следовательно, они являются не только многокомпонентными растворами, но и суспензиями. Дисперсная фаза этих суспензий состоит из мицелия или клеток микроорганизмов, а также из твердых частиц, содержащихся во многих питательных средах - муки, хлопьев из кукурузного экстракта и т.п.
Способы отделения клеточной биомассы от культуральной жидкости можно разделить на:
- механические (отстаивание, фильтрование, центрифугирование)
- теплотехнические (сушка).
В зависимости от конечной цели выбирают различные сочетания этих способов. При выборе схемы концентрирования и извлечения биомассы проводят предварительную экономическую оценку выбранного способа с учетом товарной формы биопрепаратов, концентрации организмов в культуральной жидкости и др.
Очень часто выделить целевой продукт с помощью одного метода практически невозможно. Поэтому применяют комбинацию нескольких методов.