Для ПЦР с использованием Pfu-полимеразы используются те же компоненты, заменяют только Tagbufferна Pfubuffer.
Различие состоит во временных параметрах.
Длительная первичная денатурация препарата ДНК 1 цикл 950С – 2 мин
Быстрая денатурация препарата ДНК 950С – 1 мин
Отжиг праймеров 550С – 20 сек
Элонгация 25 - 45 циклов 720С – 2 мин на 1kb(1000 пар нуклеотидов)
Длительная элонгация 720С – 10 мин
Охлаждение реакционной смеси 1 цикл 40С - ∞
3.6 Приготовление агарозного геля для электрофореза
Визуализацию результатов ПЦР проводят агарозномгеле, который представляет собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5 – 2,5% с добавлением специального красителя ДНК – бромистого этидия.
Для 1% геля - необходимо смешать 100 мл воды и 1 грамм агарозы в стеклянной посуде. Довести раствор до кипения в микроволновой печи при высокой мощности. Вытащить сосуд из печи и размешать до ресуспендирования осевшей агарозы. Охладить до температуры, комфортной для дальнейшей работы. В форму для геля установить гребенку под будущие лунки.Влить охлажденную агарозу в форму.Агароза должна доходить как минимум до половины зубца гребенки.
Когда гель затвердеет, осторожно удалить гребенку.
Рис.№7 Готовый агарозный гель
Приготовление TBEбуфера для электрофореза
Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис, а также борную или уксусную кислоты. Соответственно, буфер, содержащий борную кислоту называется TBE (tris-borate-EDTA), а буфер, содержащий уксусную кислоту TAE (tris-acetate-EDTA).
ТВЕ имеет стоковую концентрацию 10х, для электрофореза необходима концентрация 0,5х. Для приготовления 1л буфера необходимо 50 мл стокового раствора ТВЕ и 950 мл дистиллированной воды.
Электрофорез
Электрофорез ДНК в агарозном геле — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине).
Метод используется при:
ü разделение молекул ДНК и РНК по их размеру и определение размера по маркеру
ü определение примерного количества ДНК по яркости свечения
ü вырезание нужной ДНК из геля и использовать в дальнейшем
ü анализ результатов проведения ПЦР
ü используется при клонировании, при проведении операций с плазмидой - например вырезание участка из плазмиды с помощью рестриктаз и выделение его из геля после проведения электрофореза.
ü электрофорез ДНК - также применялся раньше для секвенирования по Сэнгеру, но гель использовался полиакриламидный(ПААГ) для точного разделения коротких молекул ДНК.Такой гель позволяет разделить молекулы, отличающиеся на 1 нуклеотид - хотя это и не так просто сделать.
Разделение фрагментов ДНК происходит из-за наличия у них заряда. Фосфатные остатки у нуклеотидов придают всей ДНК негативный заряд. Это делает ее растворимой в воде и привлекает ее к положительному(+) электроду. Поэтому, если поместить ДНК в электрическое поле, то она будет двигаться от минуса к плюсу. Чтобы ДНК не сильно бежала к плюсам, ее можно перемещать в какой-нибудь вязкой среде. Для этого и нужен агарозный гель.
Фрагменты ДНК, имеющие наименьшую длину, приближаются быстрее всего к + электроду, в то время как длинные фрагменты остаются максимально близко к минусу. Те же базовые принципы электрофореза могут использоваться для разделения РНК и протеинов. Увеличение концентрации агарозы в геле уменьшает скорость миграции днк и позволяет разделять малые фрагменты днк. Чем больше напряжение тем быстрее проходит форез - но слишком сильное напряжение нагреет буфер а это недопустимо. Конформацияднк тоже играет важную роль.Кольцевыеплазмиды(неразрезанные рестриктазами) двигаются с другой скоростью чем линейные или суперскрученные.
Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, маркеры), содержащих линейные фрагменты ДНК известной длины.
Для проведения электрофореза необходимо поместить гель в камеру и залить буфером, чтобы он покрыл гель примерно на 3 мм. Затем в лунки вносят маркер и продукт амплификации, смешанный с красителем.
Включаем источник питанияна 100 - 120В, от15 до 30 мин. Возле электродов должны быть небольшие пузырьки, как индикатор что форез пошел и ДНК двигается от минуса к плюсу.
Краситель в ходе фореза передвигается, по нему можно примерно определить куда могла убежать ДНК и когда закончитьсяфорез.
Рис.№8 Внесение образцов в лунки
Рис.№9 Подключение источника питания
3.9 Детекция ДНК-продуктов амлификации
После окончания электрофореза выключаем источник питания, вытаскиваем гель.Просматривают гель в УФ-свете на трансиллюминаторе и фотографируют. Гель смотреть нужно в максимально темной комнате, иначе видимый свет забьет всю флюоресценцию от этидия. На фоне темно-синей подсветки УФ в геле должны быть видны полоски красного цвета, особенно в колонке с маркером, так как концентрация маркерной ДНК достаточно большая. Эти полоски и есть флюоресценцияэтидия, который связался с ДНК.
Рис.№10 Результат электрофореза
В ходе практики я амлифицировала генетические локусы различной длины: ген фитазы АРРА (длина 1299 п.н.), фрагмент 16SрРНК (1700 п.н.), ген α – амилазы AmyLec (1800 п.н.), ген фактора плюрипотентностиSOX2 (3500 п.н.), ген полимеразы I– типа BSTI (1000 п.н.), ген человеческого γ – интерферона (489 п.н.). Результаты электрофореза представлены в приложении 1.
Заключение
В РГП «Национальный центр биотехнологии» ведутся научные работы на мировом уровне, что в будущем превратит биотехнологию Казахстана в высокодоходный бизнес наукоемких технологий, и она будет стандартом качества и высокого уровня науки.
Руководство и сотрудники НЦБ были очень доброжелательными и отзывчивыми, охотно предоставляли необходимую информацию и реагент для работы.
На практике приобрела навыки, которые являются необходимыми для моей будущей профессии. Материал полученный в ходе практики пригодится мне для написания дипломной работы.
Приложение 1
Фото №1 Ген фитазы АРРА (длина 1299 п.н.)
Фото №2 Фрагмент 16SрРНК (1700 п.н.)
Фото №3 Ген α – амилазы AmyLec (1800 п.н.)
Фото №4 Ген полимеразы I– типа BSTI (1000 п.н.)
Фото №5 Ген человеческого γ – интерферона (489 п.н.)
Фото №6 Ген фактора плюрипотентностиSOX2 (3500 п.н.)