Условно можно выделить шесть этапов производства моноклональных антител: подготовительный этап (стерилизация оборудования, приготовление среды для культивирования, её стерилизация, очистка воздуха, подготовка культуры продуцента, инокулирование среды), культивирование клеток іn vitro, получение биомассы клеток, отделение антител, очистка антител, розлив/фасовка.
Рассмотрим технологию получения моноклональных антител с использованием штамма бактерий Escherichia coli, поскольку они являются хорошо изученными и просто культивируемыми в лабораторных и промышленных условиях, обладают высокой продуктивностью и не требуют сложных и дорогих ПС, что сопряжено с меньшей сложностью и трудоемкостью методов очистки.
Модифицированный штамм с интегрированной копией плазмид, способный экспрессировать антитела, получают из лаборатории.
Ферментацию культуры проводят в течение 24 часов при температуре 37оС в присутствии СО2 (примерно 5%) в бессывороточной среде на основе RDF (RPM1 1640 (Roswell Park Memorial Institute), DME(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), F12, трансферин, инсулин, селенит натрия, этаноламин, альбумин, вода). Использование бессывороточной питательной среды для культивирования клеток позволяет существенно уменьшить риск контаминации, а также сделать биопроцесс более контролируемым. При этом повышается воспроизводимость результатов на культурах вследствие большей стабильности состава среды (свойства сыворотки могут меняться от партии к партии), снижается стоимость среды, отсутствуют специфические антитела и цитотоксичность, которую иногда проявляет сыворотка крови[12].
Для ферментации используется барботажный ферментатор с перемешиванием, так как для процесса ферментации необходим постоянный доступ воздуха.
Ферментаторы такого типа часто используются в крупнотоннажных производствах лекарственных препаратов и имеют следующие преимущества: высокая интенсивность массообменного процесса, возможность регулирования параметров (nс, Qг), стерильность процесса, отработанность конструкции. Однако при использовании таких ферментаторов следует помнить об их относительно высокой энергоемкости, сложности мойки и стерилизации из-за множества внутренних устройств[13]. В процессе ферментации используется полунепрерывный способ культивирования с подпиткой. При этом способе обеспечивается «омолаживание» или «обновление» культуры и существенно замедляется наступление фазы отмирания, однако такой способ имеет существенный недостаток: добавляется питательная среда полного состава, а это невозможно для синтеза вторичных метаболитов[14].
После культивирования клеток культуральная жидкость поступает в центрифугу для более тщательной очистки от остатков биомассы. Достоинства центрифугирования в отличие от других методов разделения – простота и экономичность процесса, низкая влажность обезвоженного осадка, возможность работы без применения реагентов.
После отделения биомассы культуральная жидкость поступает в фильтр, где фильтруется через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Для фильтрования используется мембранный фильтр из ацетата целлюлозы ввиду высокой прочности материала, низкого показателя экстрагируемости (фильтрат не загрязняется продуктами, выделяемыми материалом фильтра), гидрофильности (быстро смачивается полярным растворителем), стойкости материала (частицы мембраны не могут попасть в фильтрат)[17]. В качестве полярного растворителя используется вода.
Для более тщательной очистки культуральной жидкости проведем несколько этапов хроматографии. Для аффинной хроматографии в качестве матрицы используется сефароза, которая обладает следующими преимуществами: чрезвычайно низкая неспецифическая адсорбция, гидроксильные группы углеводных остатков идеально подходят для ковалентного связывания, открытая пористая структура, стабильность в диапазоне условий. Активацию сефарозы осуществляют в процессе инкубации раствора бромциана с водной суспензией сефарозы. Большинство макромолекул проходит через частицы носителя не задерживаясь, в то время как между антигенами, иммобилизованными на носителе, и антителами, содержащимися в растворе, образуется иммунный комплекс. После отмывки носителя от не связавшихся антител иммунный комплекс разрушают, пропуская через носитель растворы с низкими (pH 2,0 — pH 4,0) или высокими (pH 11,0 — pH 12,0) значениями рН, либо растворы с высокой ионной силой (2М NaCl), либо растворы, содержащие хаотропные соединения (KSCN). При этом исследуемые антитела элюируют с носителя, собирают и переводят в оптимальный для их хранения буфер.
После аффинной хроматографии культуральная жидкость поступает в колонку для ионообменной хроматографии размером 5-15 см, куда подается сефарозный гель и ионообменник (в нашем случае диэтиламиноэтил). В качестве начального буфера используется 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), в качестве элюирующего - 20 мМ Tris-HCl + 1М NaCl (pH 8,0). При использовании градиента соли добавляется 10-20 объемов последнего буфера. Для эффективного связывания образцы должны находится в том же рН и ионной силе, что и исходный буфер[18].
В качестве установки для вирусной инактивации можно использовать с истему вирусной инактивации UVivatec, которая имеет следующие особенности: действует на все вирусы, особенно эффективно в отношении малых безоболочечных вирусов, простая и быстрая установка и обслуживание, надежная масштабируемость, равномерное облучение в результате эффективного радиального перемешивания из-за действия завихрений Дина, малый разброс времени облучения, эффективная инактивация при минимальном воздействии на продукт[19].
Окончательную очистку антител проводят с помощью гель-фильтрации. Для этого 5 литров предварительно промытого кополимерного носителя для гель-фильтрации Toyopearl HW65F вносят в колонку сечением 100 мм и уравновешивают ее фосфатным буфером (рН 8,5), содержащим 0,3 М хлорида натрия. Препарат, полученный на предыдущей стадии, вносят в колонку и элюируют его тем же буфером с контролем фракций объемом 50 мл на содержание и электрофоретическую чистоту антител.
Вместо кополимерного носителя Toyopearl HW65F также используют агарозный носитель Sephacryl CL-4B. Однако экспериментально доказано, что кополимерный носитель для гель-фильтрации Toyopearl является предпочтительным для стадии тонкой очистки препарата.
Очищенный материал разводят фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащим 0,15 М натрия хлорида и переносят в емкость для хранения, откуда препарат отправляется на расфасовку.