Определение содержания пигментов в растении

Пигменты как составная часть фотосинтетического аппарата, часто используются для определения реакции растения на воздействия внешней и внутренней среды растения (при болезнях) для оценки его продуктивности и количественного связывания атмосферного углерода в его биомассе. В растении с уществует несколько групп пигментов: фотосинтетические, принимающие непосредственное участие в процессе фотосинтеза, и накапливающиеся в пластидах фотосинтезирующих клеток, антоцианы, содержащиеся в межклетниках или в стенках клеток растения и не принимающие непосредственного участия в фотосинтезе. Если первые образуются в процессе формирования растения при участии фермента хлорофилазы и световой энергии, то антоцианы образуются, как правило, в осенних листьях растений под действием яркого солнечного света и низких (вплоть до отрицательных) температур, придающие листьям осеннюю раскраску (в основном красную). Желтая окраска осенью у лиственных и хвойных пород свидетельствует об осеннем разрушении в них зеленых пигментов.

Имеется несколько методов определения концентрации пластидных пигментов, содержащихся в пластидах (хлоропластах) фотоситезирующих клеток растений: метод бумажной хроматографии, спектрофотометрический, тонкослойной хроматографии, разделительных ионнобменных смол и др. Мы рассмотрим два первых.

Метод бумажной фотографии (И.А.Попова «Исследования пигментов пластид с помощью хроматографии на бумаге //Л.: Тр. БИН СССР, 1963. Вып. 16. С. 154-164; Сапожников и др., 1956, 1959) основан на использовании свежего или высушенного растительного материала. Определяются следующие пигменты: хлрофилл «а», хлорофилл «b», каротин, лютеин, виолаксантин, неоксантин. Вначале готовится журнал для необходимых записей. Для определения концентрации пигментов берется навеска 0,5 г свежей хвои (одновременно берется навеска материала также на влажность). Для листьев, содержащих высокую концентрацию пигментов, в опыте можно использовать и меньшие навески листьев. Опытный материал помещается в небольшую фарфоровую ступку, к нему добавляется небольшое количество (на кончике скальпия) щелочи СаСО₃ или МgСО₃ для нейтрализации кислот (для предотвращения феофонизации), и небольшое количество стеклянного порошка для улучшения растирания. Вся масса растительного материала тщательно фарфоровым пестиком растирается с постоянным добавлением к ней небольших порций растворителя (этанола и ацетона в соотношении 1:3). После окончания растирания образовавшаяся масса тщательно тем же растворителем промывается до полного обесцвечивания, раствор переносится в мерный цилиндр на 250 мл, показания заносятся в специальный журнал. После этого раствор отфильтровывается на стеклянном фильтре № 3. Разделение пигментов проводится восходящим током растворителя с использованием хроматографической бумаги. Для этого с помощь мерной пипетки берется 1 мл фильтрата и тонкой линией в виде тонкой полоски наносится внизу хроматографической бумаги. Для разгона пигментов используется хроматографическая бумага «ленинградская быстрая» Ленинградской бумажной фабрики. Размер хроматограммы стандартный 17х19 см. После окончания нанесения и просушки в воздухе над комнатным винтилятором, хроматограмма помещается в специальный цилиндр для разгонки, в который предварительно наливается 40 мл растворителя. Растворителем служит смесь ацетон: петролейный эфир: бензин (калоша) в соотношении 7:5:17. Стакан плотно закрывается притертой крышкой и помещается в затененное место (вытяжной шкаф со шторами). Через 30-40 мин, когда фронт растворителя подойдет к верхней части хроматограммы и будет наблюдаться четкое разделение пигментов, хроматограмма из стакана извлекается и просушивается комнатным винтилятором. Затем окрашенные полосы соответствующие на бумаге определенным пигментам (в самой верхней части хроматограммы располагается хлорофилл «а», затем ниже его хлорофилл «b», в самом внизу располагаются каротиноиды: каротн, лютеин и виолаксантин, на стартовом пятне остается неоксантин) разрезаются, измельчаются и помещаются в соответствующие пробирки для перевода пигментов с бумаги в раствор и заливаются серным эфиром. Извлечение пигментов с бумаги продолжается до полного обесцвечивания бумаги. Оптическую плотность полученной вытяжек пигментов, содержащих каротин, лютеин, виолаксантин и неоксантин промеряют на ФЭК-М за синим светофильтром, каротиноиды – за красным светофильтром. Концентрацию пигментов определяют по калибровочным кривым, построенными по набору стандартных растворов известной концентрации пигмента, полученной на данном приборе (на ФЭК-М) отдельно для каждого пигмента (на оси абцисс откладывается объем элюата в мл, на ординате оптическя плотность элюата, полученная на ФЭК) и рассчитываем по формуле Веттштейна. Ниже приведен пример расчета содержания пигментов у подроста ели.

Таблица. Концентрация пигментов в хвое подроста ели в 59 летнем березняке

Спектрофотометрический метод. Этот метод считается наиболее точным, перспективным и удобным при использовании, значительно сокращающий трудоемкость работ и расход дорогостоящих химических препаратов. Его содержание подробно описано в работах А.А. Шлык «Определение хлорофилла и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев //Биохимические методы в физиологии растений. М.: Наука, 1971. С. 159-169». В.Ф. Гавриленко, М.Е. Ладыгина, Л.М. Хандобина //Большой практикум по физиологии растений. Фотосинтез. Дыханиею М.: Высшая школа, 1975. 192 с. Для опыта берутся свежесобранные листья (хвоя) от 3-5 растений, часть которых (1-3 г) в виде смешанной пробы непосредственно на ПП взвешиваются на торсионных весах ВТ-500 или ВТ-1000 и консервирются в пробирках небольшим количеством раствора либо ацетона, либо этанола. Обычно берется несколько повторных образцов с целью исключения возможной ошибки. Пробирки в пламени спиртовки нагреваются до кипения, затем помещаются в банки для охлаждения холодной водой либо льдом. После охлаждения пробирки закрываются пробкой из пробкового материала (использование каучуковых пробок невозможно из-за возможной диффузии их содержимого в опытный раствор и искажения данных), фиксируются разогретым парафином и доставляются в лабораторию. В лаборатории содержимое из пробирки извлекается, переносится в фарфоровую ступку и с помощью фарфорового пестика с добавлением небольшого количества (на кончике скальпия) щелочи (СаСО₃, либо МgСО₃) и стеклянного порошка тщательно растираются с постоянным добавлением использованного при фиксации растворителя. После полного растирания образец растворителем тщательно промывается до полного обесцвечивания. Полученный элюат переносится на стеклянный фильтр № 3 и фильтруется. После окончания фильтрования элюат переносится в мерный цилиндр на 100 или 50 мл, замеряется его объем и сливается в освободившуюся из-под него пробирку. Затем начинается промер плотности элюата на спектрофотометре. Для определения концентрации пигментов в отечественных лабораториях чаще всего используются спектрофотометры ленинградской фирмы «ЛОМО». Берутся две кюветы (поставляемые фирмой вместе с прибором) объемом по 2 мл, которые после наполнения помещаются в прибор для проработки: одна контрольная, в которую заливается чистый растворитель, который был использован для консервирования растительного материала. Во вторую кювету наливается испытуемый раствор (элюат) опытного образца. Затем начинается промер плотности раствора на следующих длинах волн: 665, 649, 440,5, соответствующих длинам волн поглощения соответствующим пигментом. Концентрацию пигментов в исходном материале определяем с применением соответствующих формул, приводимых в выше указанных работах. Измерение концентрации пигментов в исходных образцах проводится в трех биологических и двух аналитических повторностях. Концентрацию пигментов (хлорофиллов а и b, их суммарное содержание рассчитывается по формулам Вернона (Шлык, 1971; Гавриленко и др., 1976).

С_ХЛ.а = 11,63 D₆₆₅ – 2,39 D₆₄₉

C_{Хл. b} = 20,11 D ₆₄₉ – 5,18 D₆₆₅,

С_{Хл (а + b)} = 6,45 D₆₆₅ + 17,72 D₆₄₉

Концентрацию пигментов в исследуемом материале устанавливали по формуле: А= С۰V / Р۰1000

где: С – концентрация пигментов, мг/л,

V – объем вытяжки пигментов, мл,

Р – навеска растительного материала, г,

А – содержание пигментов в исходном материале, мг/г свежей массы.

Результаты выражаются в мкг на 1 г свежей массы хвои. Если при извлечении пигментов использован этанол, то для определения этим методом каротиноидов, для них готовится специальный раствор из ацетона. Т ьаким же образом осуществляется определение их концентрации. Ниже дается пример содержания пигментов в хвое подроста ели в лиственных насаждениях, определенных данным методом.

Влияние выборочной рубки на концентрацию пигментов

(мкг в 1 г свежей массы хвои) у подроста ели (высота 1,5-1,7 м)

в березняках и осинниках черничных

Пигмент	Контроль	Вырубка (45-50 % запаса)
53-летн березн.	59-летн. березняк	53-летн. осинник	53-летн. березняк	59-летн. березняк	53-летн. осинник
Хлорофилл а	680 8	718 12	814 17	580 9	618 14	640 11
Хлорофилл b	266 4	295 3	384 6	200 3	212 4	230 3
Сумма (a+b)	946 12	1013 18	1198 9	780 14	830 16	870 17
Хл. a/ Хл b	2,56	2, 43	2,12	2,90	2,98	2,78
Каротиноиды	126 2	135 2	160 4	130 3	136 4	140 2

Рисунок 2. Концентрация хлорофиллов и каротиноидов в разновозрастной хвое: a - Pinus contorta, дендропарк ст. Исакогорка; б - Pinus sylvestris, о/у «Зубово». Возраст хвои: £ -1 год, £ – 2 год, £ – 3 год, £ – 4 год.

Содержание хлорофиллов а и b в светособирающем комплексе (ССК) и хлорофилл-белковых комплексах фотосистем I и II (ХБК ФС1 и ФСII) расчитывается исходя из того, что практически весь хлорофилл b содержится в ССК, а соотношение Хл. а /Хл. b в этом комплексе составляет 1,1-1,3 (Рубин и др., 1988; Кирпичникова и др., 1985). Необходимость проведения таких расчетов диктуется теми соображениями, что стационарные уровни содержания хлорофиллов и их соотношения в ССК/ХБК закономерным образом изменяются при изменении экологических условий местообитания растений, что позволяет рассматривать данные характеристики ассимиляционного аппарата в качестве важных и перспективных для оценки состояния ассимиляционного аппарата растений в условиях меняющейся экологии (Рубин, 1988).

Оценка ежегодного фотосинтетического стока углерода проводится по хлорофилловому индексу (сумма хлорофилла для всего растения, ХИ), который вычисляется как средний из трех-пяти биологических повторных определений, взятых в отдельности для каждого возраста хвои или листьев. После определения в них концентрации хлорофилла делается перерасчет его на всю массу ассимилирующих органов среднего дерева. Хлорофилловый индекс, полученный вначале для модельного дерева, а затем определяется для всего древостоя (с учетом всего количества деревьев, имеющихся на одном га площади), перемножается на соответствующий коэффициент – для ели 111 (Цельникер, Малкина, 1994; Воронин и др., 1995) и вычисляется общий ежегодный сток углерода для всего насаждения.

Таблица 2. Хлорофилловый индекс и ежегодный сток атмосферного углерода

сосны скрученной на участке дендрологического парка, 2003 г.

Концентрация углерода в отдельных компонентах фитомассы определялась весовым методом в сухом материале с использованием стандартной рекомендации Миттхевса (цит.: Швиденко и др., 2000) путем перерасчета полученной величины массы органа на соответствующий коэффициент: для зеленых частей 0,45, для древесины 0,50.

Рис. 4 – Ежегодный сток атмосферного углерода в разновозрастной хвое: Pinus contorta £ -лесопитомник “Караси”, £ - дендропарк ст. Исакогорка; Pinus sylvestris £ - лесопитомник “Караси”.