Основные типы биологического окисления субстрата бактериями. Аэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы и облигатные анаэробы. Примеры
Дыхание микробов — это биологический процесс, сопровождаемый окислением или восстановлением различных, преимущественно органических, соединений с последующим выделением энергии в виде аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), необходимой микробам для физиологических нужд.
По типу дыхания м/о классифицируются на:
· Облигатные (безусловные) аэробы растут при свободном доступе кислорода, обладают ферментами, позволяющими передать водород от окисляемого субстрата конечному акцептору — кислороду воздуха. К облигатным аэробным микроорганизмам относятсяуксуснокислые бактерии, патогенные для человека- туберкулезная палочка, возбудители туляремии и холерный вибрион, возбудитель сибирской язвы, стрептококк и стафилококк. Всем им для жизнедеятельности необходимо высокое содержание кислорода.
· Микроаэрофильные бактерии развиваются при низкой (до 1 %) концентрации кислорода в окружающей атмосфере. Такие условия благоприятны для актиномицетов, лептоспир, бруцелл.
· Факультативные анаэробы вегетируются как при доступе кислорода воздуха, так и в отсутствие его. Имеют соответственно два набора ферментов. Это многочисленная группа микроорганизмов, к которой относятся, в частности, энтеробактерии и многие дрожжи, способные переключаться с дыхания в присутствии 02 на брожение в отсутствии 02. К этой группе относятся не только микроорганизмы типа дрожжей и палочек брюшного тифа, но и простейшие (ресничные инфузории), а также многоклеточные животные, местом обитания которых является дно водоемов – черви, моллюски.
· Облигатные (безусловные) анаэробы развиваются при полном отсутствии кислорода в окружающей среде. Анаэробные условия необходимы маслянокислым бактериям, возбудителям столбняка, ботулизма, газовой гангрены.
2. Механические, физические, химические и биологические способы создания анаэробных условий
Сущность условий, необходимых для культивирования анаэробов, заключается в снижении парциального давления молекулярного кислорода, что достигается механическими, физическими, химическими и биологическими способами.
Механические методы удаления кислорода
1. Посев анаэробной культуры уколом в высокий столбик сахарного агара или среды Вильсон-Блера. Это наиболее простой способ.
2. Способ Виньяля-Вейона. В расплавленный и остуженный до 50°С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают. В среде вырастают ясно видимые снаружи колонии бактерий, которые можно извлечь, распилив трубку.
3. Метод Перетца. В пробирку с растопленным и остужённым до 450 сахарным агаром вносится и размешивается исследуемая культура. Смесь выливается в стерильную чашку Петри, охлаждается. На поверхность накладывается стерильное стекло. Чашку в закрытом виде помещают в термостат на 18-20 часов. Под стеклом вырастают колонии, которые извлекают, отодвинув стекло.
Физические методы удаления кислорода
1. Аанаэростат, из которого воздух выкачивается насосом. Можно использовать вместо анаэростата эксикатор.
2. Аппарат Киппа, где воздух заменен индифферентным газом -водородом.
3. Среде Китта-Тароцци: (МПБ, 0,5 % глюкозы и кусочками свежих органов животных, например, печени или с мясным фаршем). Кусочки органов, а также глюкоза обладают рецидивирующими свойствами. Перед посевом её кипятят и заливают сверху стерильным вазелиновым маслом.
Химические методы удаления кислорода
1. Прибор Омелянского, где для поглащения кислорода используется пирогаллол.
2. Среда Вильсон – Блера (железо - сульфитный агар). Черные колонии образует C.perfringens за счет образования сульфата железа (FeS) (рис.19).
Биологический метод удаления кислорода по Фортнеру
В чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины, на одну половину засевают облигатный аэроб – «чудесную» палочку (S.marcescens), на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растопленным парафином. Через 24-48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, когда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы.
Этапы выделения чистой культуры анаэробных бактерий
Выделение чистых культур анаэробов изучаем на примере выделения C.perfringensиз раневого отделяемого при подозрении на газовую гангрену.
1-й этап. Обогащение на среде Китта–Тароци.
1.Приготовление мазков из раневого отделяемого и окраска по Граму. Под микроскопом видны крупные грамположительные палочки, часть которых окружены неокрасившейся капсулой (в виде белого ободка), что позволяет заподозрить газовую инфекцию.
2.Посев раневого отделяемого на среду Китта-Тароцци, предварительно прокипяченной в течении 30 минут. После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются;
3.Инкубация посевов в термостате при 370 в течение 18-24 часов.
2-й этап. Получение изолированных колоний.
1.Изучение характера роста на среде Китта-Тароцци. При росте C.perfringens она мутнеет и в ней образуется газ (результат образования газа при ферментации глюкозы).
2.Приготовление мазка из бульонной культуры и окраска по Граму. Под микроскопом видны крупные грамположительные палочки.
3.Получение изолированных колоний анаэробов двумя способами:
- на поверхности твердой питательной среды (сахарно-кровяного агара) по Цейсслеру в анаэробных условиях;
- в глубине среды Вильсон-Блера по Вейнбергу.
4.Инкубация посевов в термостате при 370 в течение 18-24 часов.
3-й этап. Выделение чистой культуры.
1.Макроскопическое изучение выросших колоний анаэробов:
а) на сахарно-кровяном агаре, обратить внимание на зону гемолиза вокруг колоний, что является признаком гемолитической активности бактерий (вирулентности);
б) в глубине среды Вильсон-Блера, обратить внимание на цвет колоний. Черные колонии образует C.perfringensза счет образования сульфата железа (FeS).
2.Приготовление из подозрительных колоний мазков и окрашивание их по Граму. Под микроскопом выявляются крупные грамположительные палочки;
3.Остаток колонии, подвергшейся микроскопическому изучению, отсевают на среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры.
4.Инкубация посевов в термостате при 370 в течение 18-24 часов.
4-й этап. Идентификация выделенной чистой культуры анаэробов.
1.Макроскопическое определение роста культуры на среде Китта-Тароцци;
2. Проверка выделенной культуры на чистоту - приготовление мазков со среды Китта-Тароцци и окрашивание их по Грамму. Во всех полях зрения чистая культура должна быть однородной морфологически и тинкториально.
3.Окончательная идентификация выделенной чистой культуры анаэробов
проводится по токсигенности в реакции нейтрализации экзотоксина на белых мышах, биохимическим, антигенным свойствам и по генетической структуре.
5-й этап. Учет результатов идентификации и оформление заключения о виде.
Например, выделена чистая культура C.perfringens, идентификация проведена по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным, токсигенным свойствам и по генетической структуре.
4. Особенности культивирования риккетсий, хламидий, микоплазм.
Риккетсии и хламидии – бактерии, которые, как и вирусы, являются облигатными внутриклеточными паразитами. Поэтому для их культивирования применяются:
а)тканевые культуры;
б)куриные эмбрионы;
в)лабораторные животные.
Культивирование риккетсий проводят на переживающих тканях в жидкой среде Мейтлендов (раствор Тироде и сыворотка) при 37° С 10-14 дней или на Тироде-сывороточном агаре с добавлением на поверхность измельченной эпителиальной ткани при 37° С 6-10 дней.
Риккетсии культивируют в организме белых мышей, которых заражают интраназально. В легких мышей накапливается большое количество риккетсий.
Широко используется культивирование в 8-12-дневном курином эмбрионе. Эмбрион заражают в полость желточного мешка или на хорион-аллантоисную оболочку. Зараженные яйца помещают в термостат при 37 
С на 6-7 дней. Этот метод используется при изготовлении вакцин и диагностических препаратов на риккетсий.
Риккетсии выращивают по методу Вейгля и Мосинга. Для этого платяных вшей заражают взвесью риккетсий путем введения в кишку через анальное отверстие с помощью специальных капилляров.
Пшеничнов и Райхер разработали метод культивирования риккетсий на личинках вшей, которых кормят дефибринированной кровью с риккетсиями через мембрану кожи трупа.
Хламидии, являясь облигатными паразитами, на искусственных питательных средах не размножаются, их можно культивировать только в живых клетках. Они являются энергетическими паразитами, так как не способны самостоятельно аккумулировать энергию и используют АТФ клетки-хозяина.
Культивируют хламидий в культуре клеток HeLa, McCoy, в желточных мешках куриных эмбрионов, организме чувствительных животных при температуре 35 °С.Цитоплазма инфицированных клеток выглядит гранулированной.
HeLa – это клеточная линия, которая была получена послевзятия клеток опухоли шейки матки Генриетты Лакс методом биопсии. Эти клетки стали первыми человеческими клетками, способными делиться в лабораторных условиях.
Выделение хламидий в культуре клеток МсСоу. Для этой цели обычно используют чувствительную культуру клеток, обработанную циклогексимидом. Чувствительность микробиологического метода составляет 70-80%, но в то же время микробиологический метод исследования превосходит молекулярно-биологические методы диагностики по специфичности. ПЦР
Микоплазмы культивируются на питательных средах с добавлением сыворотки и углеводов. Поскольку микоплазмы лишены клеточной стенки, они растут только в изотонических или гипертонических средах. На плотных питательных средах в течение нескольких суток образуются очень мелкие колонии, напоминающие яичницу-глазунью - с выпуклым центром и плоской полупрозрачной периферией. Микоплазмы можно выращивать также на курином эмбрионе или культуре клеток.
Культуральные свойства
Размножение микоплазм может происходить путем бинарного деления, фрагментации, почкования. Микоплазмы являются факультативными анаэробами, обладают слабой ферментативной активностью, имеют ограниченные биосинтетические возможности, чрезвычайно требовательны к питательным средам и условиям культивирования. Оптимальная температура культивирования 36-37ОС. Время выращивания - 5-7 дней.
В состав питательных сред для культивирования микоплазм входят аминокислоты, холестерин, жирные кислоты, фосфолипиды, пурины, пиримидины, глюкоза, сыворотка крови. Основным источником энергии для микоплазм является глюкоза или аминокислоты (аргинин). Для выращивания уреаплазм в среды добавляют мочевину. Для подавления посторонней микрофлоры используют пенициллин и его аналоги (при культивировании микоплазм) или линкомицин (при культивировании уреаплазм). Большинство микоплазм хорошо растут в атмосфере, состоящей из 95% азота и 5% углекислого газа. На плотных питательных средах через 2-3 суток и более микоплазмы образуют очень мелкие врастающие в среду колонии (0,1-0,3 мм) с приподнятым центром, похожие на яичницу-глазунью
При размножении на питательных средах биосинтез нуклеиновых кислот происходит путем извлечения микоплазмами нуклеотидов и нуклеозидов из среды. При недостатке предшественников нуклеиновых кислот репликация нуклеоидов ингибируется и образуются мини-клетки, не содержащие ДНК.
Все представители рода микоплазм стеролозависимые и нуждаются для роста в экзогенном холестерине, не гидролизуют мочевину.
Уреаплазмы также являются стеролозависимыми, но гидролизуют мочевину.
В толще полужидкого агара микоплазмы и уреаплазмы растут по ходу укола в виде облачка, заметного в проходящем свете