Метод Циля-Нильсена предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых.

ТЕМА: МЕТОДЫИССЛЕДОВАНИЯ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

1. Защитные приспособления у микроорганизмов. Споры, стадии и условия образования спор, биологическое значение.

2. Капсулы бактерий, их значение.

3. Жгутики, их строение. Реснички. Секс-пили.

4. Сложные способы окраски. Техника окраски по Граму, Цилю-Нельсену, Бурри-Гинсу, Нейссеру.

5. Методы исследования микроорганизмов в живом состоянии. КОН-тест. Принцип метода.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Техника окраски по Граму (указать, в какие цвета окрашиваются бактерии на каждом этапе окрашивания по методу Грама/ раскрасить таблицу)

Этап окраски	Грамположительные бактерии	Грамотрицательные бактерии
1. Окрашивание генцианвиолетом (генциановым фиолетовым) (время экспозиции 1минута)
2. Обработка раствором Люголя (время экспозиции 1минута))
3. Обработка 96% спиртом (время экспозиции 1минута)
4. Окрашивание водным фуксином или сафранином (время экспозиции 2 минуты))

Основные морфологические группы бактерий (изобразите в виде цветных рисунков в соответствии с окраской по Граму):

КОККИ
Диплококки	Стрептококки	Стафилококки	Сарцины
ПАЛОЧКИ
Бактерии	Бациллы	Стрептобациллы	Клостридии
ИЗВИТЫЕ ФОРМЫ
Вибрионы	Спириллы	Спирохеты

1►Окраска по Граму мазков из бульонной культуры стафилококка, агаровой культуры кишечной палочки и их смеси. Зарисовка препаратов.

Смесь бактерий (Staphylococcus aureus, Escherichia coli) Окраска по Граму Увеличение x 630

2►Приготовление мазка из культуры дифтерийной палочки, окраска метиленовым синим по Леффлеру и по Нейссеру. Зарисовка препаратов.

Corynebacterium diphtheriae Окраска по Леффлеру Увеличение x 630

Corynebacterium diphtheriae Окраска по Нейссеру Увеличение x 630

3►Постановка и учет результатов КОН-теста с культурами золотистого стафилококка и кишечной палочки.

Результат КОН-теста (с 3% раствором) Staphylococcus aureus стенка не разрушается, Escherichia coli стенка разрушается образуются тянущиеся за петлей слизистые нити.

ДЕМОНСТРАЦИИ

C.diphtheriae	Bordetella	Escherichia coli	B. anthracis
окраска метиленовым синим по Леффлеру	окраска по Граму	окраска по Граму	окраска по Граму
Палочки неправильной формы, беспорядочно, «римские V и X »	Коккобактерии – слегка вытянутые палочки	Палочки с закругленными концами	Стрептобациллы, образующие в организме капсулу

(указать методы окраски микроскопических препаратов и особенности морфологии микроорганизмов – форму и расположение в препарате)

4►Приготовление мазка из агаровой культуры спороносных бацилл, окраска по Цилю-Нельсену (или по методу Ожешко), микроскопия и зарисовка.

Техника окраски по Цилю-Нельсену (указать, в какие цвета окрашиваются бактерии на каждом этапе окрашивания/ раскрасить таблицу)

Этап окраски	Окраска спор по Ожешко На нефиксированный мазок наносят 0,5% р-р HСl и подогревают 1-2 минуты над рламенем, промывают водой, фиксируют и далее см. ниже	Окраска кислото-устойчивых бактерий
1. Обработка на мазок наносят фильтровальную бумагу наливают карболовый фуксин Циля и нагревают над пламенем спиртовки до отхождения паров (время экспозиции до отхождения паров) Также необходимо снять бумажку, остудить препарат, сполоснуть водой
2!. Обработка 5% раствором H2SO4 Концентрация 5%
3. Окрашивание водным раствором метиленового синего (время экспозиции) 3-5 минут

* МТ – Mycobacterium tuberculosis; Str – стрептококк.

5►Микроскопия препаратов микроорганизмов, окрашенных по Цилю-Нельсену. Зарисовка препаратов.

Bacillus anthracoides Окраска по Цилю-Нельсену. Увеличение x 630

Mycobacterium tuberculosis в мокроте Окраска по Цилю-Нельсену. Увеличение x 630

6►Приготовление мазка из агаровой культуры палочки риносклеромы, окраска по Бурри-Гинсу, микроскопия и зарисовка.

Klebsiella rhinoscleromatis Окраска по по Бурри-Гинсу Увеличение x 630

7►Приготовление препарата «раздавленная капля» или «висячая капля» из сенного настоя для изучения подвижности (указать особенности микроскопии препарата)

1 этап

2 этап

3 этап

1) Нанесение взвеси микроорганизмов на покровное стекло;

2) Смазывание краев лунки на предметном стекле вазелином и помещение покровного стекла на предметное стекло; 3)Готовый препарат, микроскопируют с иммерсионным обьективом

Бакте́рии (др.-греч. βακτήριον — палочка) — группа (царство) прокариотных (безъядерных) микроорганизмов, чаще всего одноклеточных. К настоящему времени описано около десяти тысяч видов бактерий и предполагается, что их существует свыше миллиона, однако само применение понятия вида к бактериям сопряжено с рядом трудностей.

Спириллы отличаются спиральным (штопор) строением клетки и биполярным расположением жгутиков; энергию они получают за счет дыхания. Выделяют несколько родов спирилл. S. volutans - гигантская спирилла, которую всегда можно найти в свиной навозной жиже; она получила известность благодаря открытию «волютина» (полифосфатов); в чистой культуре растет только при пониженной концентрации 02 (примерно 5%), ее следует поэтому считать микроаэротолерантнои. Spirillum minus –возбудитель Содоку – болезни укуса крыс.

Метод Нейссера используется для выявления зерен волютина. Мазок окрашивается уксуснокислым метиленовым синим 2-3 минуты, при этом происходит химическое взаимодействие красителя и волютина. Зерна волютина окрашиваются в черный цвет. При промывке водой тело клетки обесцвечивается и затем в течение 1 мин докрашивается везувином в желто-коричневый цвет.

Метод Циля-Нильсена предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых.

1. Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании 3-5 мин.
2. Обесцвечивают раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение 1-2 мин.
3. Промывают водой.
4. Докрашивают 3-5 мин метиленовым синим (дополнительный краситель).

Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий отличается высоким содержанием липидов. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии легко окрашиваются, а затем легко обесцвечиваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем.

Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. После протравы соляной кислотой при нагревании в течение 2-3 мин мазок фиксируется и окрашивается по методу Циля-Нильсена. При этом цитоплазма клетки окрашивается в синий цвет, а споры в красный.

Метод Бурри-Гинса используется для окраски капсульных бактерий и основан на том, что капсула не воспринимает красители. Капсулу выявляют негативным контрастированием фона по Бури. Для этого черную тушь смешивают в культурой и высушивают. После этого проводят фиксацию в пламени горелки, окрашивают тела микробных клеток по Гинсу - водным фуксином в течение 1 минуты и промывают водой 5-10 секунд. В результате на темном фоне хорошо видна бесцветная капсула и красные тела микробов.