Цель: Освоить бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.
Знать:
1. Принципы систематики и классификации бактерий.
2. Этапы определения вида бактерий при проведении бактериологического метода.
Уметь:
1. Учесть и оценить результаты посева исследуемой культуры на «пестрый» ряд, среду для определения подвижности.
2. Учесть и оценить результаты определения антибиотикограммы исследуемой культуры.
3. Обобщить результаты исследований на всех этапах бактериологического метода, определить видовую принадлежность исследуемой культуры, используя определитель бактерий Берджи.
Контрольные вопросы:
1. Принципы классификации бактерий.
2. Понятия: вида микроорганизмов; внутривидовых категорий (хемовар, серовар, фаговар, биовар); штамма, клона.
3. Бинарная номенклатура бактерий.
4. Этапы определения вида микроорганизмов при проведении бактериологического метода..
5. Методы идентификации бактерий с учетом морфо-тинкториальных, культуральных, биохимических свойств, подвижности.
6. Диско-диффузионный метод определения антибиотикограмм бактерий.
7. Категории бактерии по степени чувствительности к антибиотикам.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
I. Провести IV этап бактериологического метода выделения чистых культур аэробов:
- учесть и оценить результаты посева исследуемой культуры на “пестрый” ряд, среду для определения подвижности;
- заполнить паспорт исследуемой культуры;
- определить видовую принадлежность исследуемой культуры;
- учесть и оценить результаты определения антибиотикограммы исследуемой культуры.
II. Для изучения микрофлоры кожи рук провести посев отпечатков пальцев.
III. Контрольная работа “Морфология и физиология микроорганизмов”.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
I. Провести IV этап бактериологического метода выделения чистых культур аэробов.
1.1. Учтите результаты посева на III этапе бактериологического метода исследуемой культуры на короткий «пестрый» ряд: среда Гисса с глюкозой, лактозой, маннитом и МПБ. На МПБ, помимо учета образования индола и Н2S, опишите характер роста.
На среде для определения подвижности определите подвижность и тип дыхания исследуемой культуры.
Полученные результаты занесите в протокол.
В случае необходимости проводят изучение других свойств, в том числе культуральных (рост при разных температурах), биохимических (образование оксидазы, каталазы и др.), антигенных, фаголизабельности и др. (приложение №1). В частности, при идентификации стафилококков изучается способность исследуемой культуры ферментировать глюкозу и маннит в анаэробных условиях и коагулировать плазму. Для определения анаэробной ферментации указанных углеводов посев производится в высокие столбики полужидкой среды Гисса с добавлением 0,2 мл стерильного вазелинового масла. Плазмокоагулазная активность изучается в реакции коагуляции плазмы (РПК): 0,3-0,5 мл плазмы кролика, разведенной 1:5, вносится в стерильную пробирку и в ней суспендируется одна петля суточной агаровой культуры. Учет результатов осуществляется через 2, 3, 18, 24 ч визуально по свертыванию плазмы (образование сгустка). Если Вы проводите идентификацию культуры стафилококков, учтите и внесите в протокол результаты определения анаэробной ферментации глюкозы и маннита, плазмокоагулазной активности (демонстрация).
1.2. По результатам всех этапов исследования заполните паспорт изученной культуры (приложение №2).
1.3. Проведите идентификацию исследуемой культуры.
Критерием для идентификации, т.е. определения вида, является наличие у исследуемой культуры таксономических признаков, характерных для конкретного вида микроорганизмов.
Наибольшее практическое значение имеет идентификация, основанная на морфо-тинкториальных, культуральных, биохимических и других легко выявленных свойствах бактерий. Более того, даже начальные этапы исследования могут дать ценную информацию для выбора средств этиотропной терапии. Установление вида производится согласно международной таксономии бактерий по определителю Берджи (Bergey,s Manual of Determinative Bacteriology, 1994). Результат идентификации занесите в паспорт культуры и протокол.
1.4. Проведите учет и оценку результатов определения антибиотикограммы исследуемой культуры. Для этого замерьте величины диаметров зоны подавления роста вокруг дисков и сравните с величинами зон подавления роста, указанными в таблицах предприятия-изготовителя дисков. После этого отнесите исследуемую культуру в отношении испытанных антибиотиков к чувствительной, умеренно резистентной или резистентной.
Для клинического применения рекомендуется использовать, как правило, антибиотики к которым культура чувствительна.
Необходимо помнить, что исход терапии зависит не только от активности антибиотиков in vitro в отношении возбудителя инфекции, но и от ряда других факторов – локализации инфекции, фармакокинетики антибиотиков и др. В этой связи при назначении антибиотиков клиницист руководствуется не только результатами антибиотикограммы, но и знаниями в области клинической фармакологии антимикробных препаратов.
II. Для изучения микрофлоры кожи рук на занятии № 7 по теме «Нормальная микрофлора человека» проведите посев методом отпечатков пальцев на обычный питательный агар.
III. Контрольная работа «Морфология и физиология микроорганизмов».
Вопросы для самоподготовки:
1. Основные различия в ультраструктуре клеток прокариотических и эукариотических микроорганизмов.
2. Основные формы бактерий; структура клетки, определяющая ее форму.
3. Обязательные и необязательные структуры бактериальной клетки.
4. Особенности строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Метод ее изучения в микробиологической практике.
5. Субклеточные формы бактерий (протопласты, сферопласты, L-формы): их особенности, факторы образования.
6. Значение L-трансформации бактерий в патогенезе инфекционных заболеваний; особенности диагностики и лечения инфекционных заболеваний, вызванных L-формами.
7. Капсулы, споры, жгутики, зерна волютина: химический состав, функции, методы изучения.
8. Основные методы изучения морфологии и структуры бактерий. Простые и сложные методы окраски: их особенности, назначение, примеры.
9. Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний: суть, достоинства и недостатки. Приведите примеры.
10. Особенности метаболизма бактерий: интенсивность обмена веществ, разнообразие типов метаболизма, метаболистическая пластичность.
11. Принципы культивирования бактерий.
12. Классификация бактерий по типам питания.
13. Питательные среды: определение, требования к питательным средам, классификация. Особенности состава и области применения общеупотребляемых, дифференциально-диагностических, элективных и специальных сред.
14. Пути поступления питательных веществ в бактериальную клетку, их сущность.
15. Ферменты микроорганизмов. Классы ферментов. Экзо- и эндоферменты, конститутивные и индуцибельные ферменты, их значение в жизнедеятельности микроорганизмов.
16. Принцип и методы изучения биохимической активности бактерий. Использование ее для идентификации бактерий.
17. Дыхание бактерий. Аэробный и анаэробный типы биологического окисления. Классификация бактерий по типу дыхания.
18. Рост и размножение бактерий. Механизм и скорость размножения. Фазы роста бактерий в жидкой питательной среде.
19. Принцип получения чистых культур микроорганизмов. Способы разобщения микробных клеток, их сущность.
20. Бактериологический метод диагностики: суть, этапы и их цель, последовательность выполнения работы.
21. Достоинства бактериологического метода как «золотого стандарта» в микробиологической диагностике инфекционных заболеваний; ученый его разработавший. Время выдачи ответа и отчего оно зависит.
22. Особенности выделения и идентификации чистых культур анаэробных бактерий. Способы создания анаэробиоза: физический, химический, биологический, комбинированный.
23. Определение понятий: вид, внутривидовые категории (серовар, биовар, фаговар и др.), штамм, клон.
24. Признаки, лежащие в основе современной таксономии микроорганизмов; их характеристика.
25. Действие физических и химических факторов на микроорганизмы. Механизмы их повреждающего действия. Стерилизация. Методы стерилизации, аппаратура, режимы стерилизации. Контроль режима стерилизации. Дезинфекция. Основные группы дезинфектантов, область и способ их применения. Асептика, антисептика.
Вопросы для самоконтроля:
1. Какие признаки бактерий лежат в основе фенотипической и генотипической классификаций.
2. Какой таксономический признак бактерий лежит в основе их деления на четыре основные категории в определителе Берджи.
3. Обосновать необходимость унификации в таксономии бактерий.
4. Что определяет выделение внутривидовых категорий бактерий.
5. Классификация бактерий по степени чувствительности к антибиотикам и какие препараты следует использовать в терапии инфекционных заболеваний.
Литература:
Учебники:
1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С. 26-29.
2. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 38-44, 177-178.
Дополнительная литература:
1. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. – М.: Мир, 1997.
Лекции по микробиологии.
Тесты.
Приложение 1
Схема бактериологического метода при микробиологической диагностике
инфекционных заболеваний.
Суть бактериологического метода: выделение чистой культуры предполагаемого возбудителя, определение его видовой принадлежности с целью диагностики заболевания и определения антибиотикограммы с целью рациональной терапии.
Цель: получение изолированных колоний
I этап.
по Граму
 | |||
 | |||
t°
t
исследуемый
материал
питательная
среда
II этап. Цель: накопление чистой культуры
 | | ||||||||||
| |||||||||||
 | |||||||||||
 | |||||||||||
 | |||||||||||
t° to
t
по Граму скошенный
агар
III этап. Цель: идентификация исследуемой культуры и определение ее антибиотикограммы
 |
t° t° t° t°
t t t t
по Граму “ Пестрый ряд ” РА с диагностич. р-ция фаголизиса метод дисков
сыворотками
IV этап. Учет результатов. Выдача ответа Цель: идентификация исследуемой. культуры (определение вида, биовара,