Химизм молочнокислого брожения.

Молочнокислое брожение

Молочнокислое брожение - это анаэробное превращение сахара молочнокислыми бактериями с образованием молочной кислоты.

По характеру брожения различают 2 группы молочнокислых бактерий: гомоферментативные и гетероферментативные.

Гомоферментативные бактерии образуют в основном (не менее 85-90%) молочную кислоту и очень мало побочных продуктов. Гетероферментативные бактерии менее активные кислотообразователи. Наряду с молочной кислотой они образуют значительное количество других веществ-этиловый спирт, углекислый газ, ацетон, кислоты.

Химизм молочнокислого брожения.

Процесс превращения глюкозы до пировиноградной кислоты у гомоферментатавных молочнокислых бактерий протекает как и у дрожей приспиртовом брожении. Далее ввиду отсутствия у этих бактерий пируватдекарбоксилазы, пировиноградная кислота не подвергается расщеплению, она является в этом брожении конечным акцептором водорода. Пировиноградная кислота вступает во взаимодействие с восстановленным НАД Н2 (кофермент) - образуется молочная кислота.

СНзСОСООН + НАД Н2- СНзСНОНСООН

Превращение глюкозы гетероферментативными бактериями происходит по-иному. Отсутствие у них фермента адьдолазы меняет начальный путь превращения глюкозы. После фосфорилирования гексоза окисляется (отщепляется водород) и декарбоксилируется (отщепляется углекислый газ), превращаясь в пентозофосфат. Пентозофосфат при участии фермента фосфокеталазы расщепляется на фосфоглицериновый альдегид. Фосфорглицериновый альдегид превращается в пировиноградную кислоту, которая восстанавливается в молочную.

Гексоза —-пентофасфат—-фосфоглицериновый альдегид—-пируват—молочная кислота

Возбудители молочнокислого брожения- молочнокислые бактерии имеют круглую палочковидную форму. Все молочнокислые бактерии неподвижны, не образую спор, грамположительные факультативные анаэробы. Они требовательны к составу питательный среды и хорошо развиваются только при наличии полного набора аминокислот и витаминов В1, В6, РР. По отношению к температуре молочнокислые бактерии разделяются на мезофильные- с мах температурой роста-25-35 С и термофильные с оптимум около 4-45 С. Некоторые бактерии способны к слезообразованию. В питательной среде они снижают рН ниже 5 и тем самым подавляют рост других анаэробных бактерий, которые не могут развиваться в кислой среде, на различных растениях, в почве, на пищевых продуктах, в кишечнике человека.

Молочнокислое брожение и семейство Lactobacillaceae

Молочнокислые бактерии объединяют в сем. Lactobacillaceae. Хотя эта группа морфологически гетерогенна (включает длинные и короткие па­лочки, а также кокки), в физиологическом отношении ее можно охарактеризовать достаточно хорошо. Все относящиеся к ней бактерии грам-положительны, не образуют спор (за исключением Sporolactobacillus inulinus) и в подавляющем большинстве неподвижны. Все они исполь­зуют в качестве источника энергии углеводы и выделяют молочную кислоту. В отличие от Enterobacteriaceae, тоже образующих лактат, мо­лочнокислые бактерии способны только к брожению; они не содержат гемопротеинов (таких, как цитохромы и каталаза). Несмотря на это, Lactobacteriaceae могут расти в присутствии кислорода воздуха; будучи анаэробами, они все же аэротолерантны. Если какая-нибудь бактерия растет в аэробных условиях, но не образует каталазу, ее с большой ве­роятностью можно отнести к молочнокислым бактериям. Потребность в факторах роста.Еще один отличительный признак молочнокислых бактерий-это их потребность в ростовых веществах. Ни один представитель этой группы не может расти на среде с глюко­зой и солями аммония. Большинство нуждается в ряде витаминов (лак­тофлавине, тиамине, пантотеновой, никотиновой и фолиевой кислотах, биотине) и аминокислот, а также в пуринах и пиримидинах. Культиви­руют эти бактерии преимущественно на сложных средах, содержащих относительно большие количества дрожжевого экстракта, томатного сока, молочной сыворотки и даже крови. Неожиданным оказалось то, что некоторые молочнокислые бактерии (и другие организмы, осущест­вляющие брожение) при росте на средах, содержащих кровь, образуют цитохромы и даже, возможно, способны осуществлять фосфорилирова-ние в дыхательной цепи. Молочнокислые бактерии не могут, следова­тельно, синтезировать порфирины; если же порфирины добавлены в пи­тательную среду, то некоторые из этих бактерий способны образовать соответствующие геминовые пигменты. Таким образом, молочнокислые бактерии-это своего рода «метабо­лические инвалиды», которые, вероятно в результате своей специализа­ции (рост в молоке и других средах, богатых питательными и ростовы­ми веществами), утратили способность к синтезу многих метаболитов. С другой стороны, многие из них обладают способностью, которой нет у большинства других микроорганизмов; они могут использовать мо­лочный сахар (лактозу). В этом они сходны с многими кишечными бак­териями (например, Escherichia coli). Лактоза в растительном царстве, по-видимому, не встречается; она образуется у млекопитающих, выде­ляется с молоком и соответственно с ним же поглощается. Таким обра­зом, способность использовать лактозу можно считать приспособле­нием к среде, характерной для кишечника млекопитающих. Лактоза-дисахарид, который, прежде чем вступить на путь катаболизма гексоз, должен быть расщеплен: Лактоза + Н20 ^Галактозидаза ^ 0-Глюкоза + D-Галактоза Галактоза после фосфорилирования превращается в глюкозофосфат. В связи с образованием больших количеств молочной кислоты пита­тельная среда для молочнокислых бактерий должна быть хорошо забу-ферена. Чаще всего с этой целью добавляют карбонат кальция. На ага-ризованной среде со взвесью СаСОэ («меловом агаре») образование кислоты обнаруживается по прозрачным ореолам вокруг колоний. Распространение и места обитания. Распространение молочнокислых бактерий в природе определяется их сложными потребностями в пита­тельных веществах и способом получения энергии (только брожение). Эти бактерии почти никогда не обнаруживаются в почве или водоемах. В естественных условиях они встречаются: а) в молоке, местах его переработки и молочных продуктах (Lactobacillus lactis, L. bulgaricus, L. helveticus, L. casei, L. fermentum, L brevis; Streptococcus lactis, S. diacetilactis); б) на растениях и на разлагающихся растительных остатках (Lactobacillus plantarum, L. delbriickii, L. fermentum, L. brevis; Streptococcus lactis; Leuconostoc mesenteroides); в) в кишечнике и на слизистых оболочках человека и животных (Lactobacillus acidophilus; Bifidobacterium; Streptococcus faecalis, S. salivarius, S. bovis, S. pyogenes, S. pneumoniae). Streptococcus faecalis -обычный обитатель кишечника человека; S. bovis распространен в пищеварительном тракте жвачных. Многие стреп­тококки являются безобидными обитателями слизистых рта, дыха­тельных и мочевых путей, половых органов; однако среди стрептокок­ков есть и паразиты крови-весьма вирулентные возбудители бо­лезней. Благодаря образованию больших количеств молочной кислоты, к которой сами они в значительной степени толерантны, молочно­кислые бактерии при подходящих условиях могут довольно быстро раз­множаться, вытесняя другие микроорганизмы. По этой причине их лег­ко культивировать на элективных средах и легко выделять. «Есте­ственные накопительные культуры» этих бактерий содержатся в кислом молоке и молочных продуктах, кислом тесте, кислой капусте, силосе и т.п. Катаболизм углеводов и продукты брожения. В зависимости от того, какие продукты образуются при сбраживании глюкозы-только молоч­ная кислота или также другие органические продукты и С02,-молочнокислые бактерии принято подразделять на гомофермен-тативные и гетероферментативные (табл. 8.2). Это старое деление отра­жает коренные различия в путях катаболизма Сахаров. Гомоферментативное молочнокислое брожение. Гомоферментативные молочнокислые бактерии образуют практически только одну молочную кислоту (она составляет не менее 90% всех продуктов брожения). Ката­болизм глюкозы происходит у них по фруктозобисфосфатному пути (бактерии обладают всеми необходимыми для этого ферментами, вклю­чая альдолазу), а водород, отщепляющийся при дегидрировании глице-ральдегид-3-фосфата, передается на пиру ват:     От стереоспецифичности лактатдегидрогеназы (а) и от наличия лак-татрацемазы зависит, какой продукт образуется - D (-)-, L(+)- или DL-молочная кислота. Лишь небольшая часть пирувата декарбоксили-руется, превращаясь в уксусную кислоту, этанол и С02, а также в аце-тоин. Количество образующихся побочных продуктов зависит, по-види­мому, от доступа кислорода. Гетероферментативное молочнокислое брожение.У гетерофермента-тивных молочнокислых бактерий нет главных ферментов фруктозобис-фосфатного пути - альдолазы и триозофосфат-изомеразы. Начальное превращение глюкозы идет у них исключительно по пентозофосфатно-му пути, т.е. через глюкозо-6-фосфат, 6-фосфоглюконат и рибулозо-5-фосфат (см. рис. 7.4 и 8.2). Рибулозо-5-фосфат под действием эпимеразы превращается в ксилулозо-5-фосфат, который в результате тиаминпиро-фосфат-зависимой реакции, катализируемой пентозофосфокетолазой, расщепляется с образованием глицеральдегидфосфата и ацетилфосфата: Нерастущие, отмытые клетки Leuconostoc mesenteroides сбраживают глюкозу почти стехиометрически согласно уравнению с6н12о6 -> сн3-снон-соон + сн3-сн2он + со2 в лактат, этанол и двуокись углерода. Таким образом, у этих бактерий ацетилфосфат восстанавливается через ацетил-СоА и ацетальдегид в этанол (рис. 8.2). Другие гетероферментативные молочнокислые бак­терии переводят ацетилфосфат частично или целиком в уксусную кисло­ту, что сопровождается переносом высокоэнергетической фосфатной связи на ADP с образованием АТР. Избыток водорода передается в этом случае глюкозе, из которой образуется маннитол. Глицеральде-гидфосфат через пируват превращается в лактат. Рибозу Leuconostoc mesenteroides сбраживает в лактат и ацетат. При сбраживании фруктозы гетероферментативными бактериями образуются лактат, ацетат, С02и маннитол: 3 Фруктоза -» Лактат + Ацетат + С02 + Маннитол Фруктоза при этом служит акцептором избыточных восстановительных эквивалентов: Фруктоза + NADH2 -» Маннитол + NAD Lactobacillus plantarum (= pentosus или arabinosus) сбраживает глюко­зу по гомоферментативному пути, а пентозы расщепляет с помощью фосфокетолазы, превращая в лактат и ацетат. Следует отметить, что да­же такая типичная гомоферментативная бактерия, как Lactobacillus casei, хотя и сбраживает глюкозу по гомоферментативному, пути, но рибозу превращает в ацетат и лактат гетероферментативным путем. Рибоза ин­дуцирует у нее синтез фосфокетолазы. Если клетки, выросшие на среде с рибозой, отмыть, то после этого они и глюкозу будут сбраживать как гетероферментативные бактерии. Брожение, осуществляемое Bifidobacterium bifidum. Гетерофермента-тивная молочнокислая бактерия В. bifidum получила это название за   свою V- или Y-образную форму (лат. bifidus- раздвоенный)1. Она из­вестна тем, что преобладает в кишечнике грудных детей, особенно де­тей, вскармливаемых грудью. Эту зависимость ее распространения от способа кормления грудного ребенка можно было связать с потреб­ностью бактерии в углеводах, содержащих N-ацетилглюкозамин, ко­торые имеются только в молоке человека, но не коровы. Все представи­тели рода Bifidobacterium- строгие анаэробы; они не переносят присут­ствия кислорода, и для их роста нужна атмосфера, содержащая 10% С02. С тех пор как стали известны эти необычные для молочнокислых бактерий особенности, бифидобактерии были обнаружены и в кишечной флоре взрослых людей, и во многих других местах, даже в гниющем иле, и теперь различают много видов этого рода. Бифидобактерии рас­щепляют глюкозу согласно уравнению 2С6Н1206 -> 2СН3 СНОН-СООН + ЗСН3-СООН т.е. сбраживают ее по фосфокетолазному побочному пути. Они не имеют ни альдолазы, ни глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, но содержат активные фосфокетолазы, расщепляющие фруктозо-6-фосфат и ксилуло-зо-5-фосфат на ацетилфосфат и эритрозо-4-фосфат или глицеральде-гид-3-фосфат. Гексозы претерпевают следующие превращения: Применение молочнокислых бактерий в домашнем хозяйстве, сельском хозяйстве и для приготовления пищевых продуктов.Если нестерильный раствор, содержащий наряду с сахарами также сложные источники азо­та и факторы роста, оставить без доступа воздуха или просто налить в сосуд достаточно большое количество такого раствора, то вскоре в нем появятся молочнокислые бактерии. Они снижают рН до значений < 5 и тем самым подавляют рост других анаэробных бактерий, ко­торые не могут развиваться в столь кислой среде. Какие именно молоч­нокислые бактерии вырастут в таких накопительных культурах, зависит от прочих условий. Благодаря своему стерилизующему и консервирую­щему действию, основанному на подкислении среды, молочнокислые бактерии используются в сельском и домашнем хозяйстве и в молочной промышленности. Приготовление силоса.Молочнокислые бактерии, обитающие на рас­тениях, играют большую роль при запасании впрок кормов для скота. Для приготовления силоса используют листья сахарной свеклы, кукуру­зу, картофель, травы и люцерну. Растительную массу прессуют и прибавляют к ней мелассу, чтобы повысить отношение C/N, и му­равьиную или какую-либо неорганическую кислоту, чтобы заранее обес­печить преимущественный рост лактобацилл и стрептококков. В таких условиях происходит контролируемое молочнокислое брожение. Приготовление кислой капусты.Кислая капуста тоже представляет собой продукт, в приготовлении которого участвуют молочнокислые бактерии. В мелко нарезанной, посыпанной солью (2-3%) и спресован­ной белокочанной капусте при исключении доступа воздуха начинается спонтанное молочнокислое брожение, в котором принимает участие сначала Leuconostoc (с образованием С02), а позднее Lactobacillus plantarum. Молочные продукты.Молочнокислые бактерии, образующие кислоту и придающие продуктам определенный вкус, находят широкое примене­ние в молочной промышленности. Стерилизованное или пастеризован­ное молоко или же сливки сбраживают, прибавляя в качестве закваски чистые («стартовые») культуры молочнокислых бактерий. Кисломолоч­ное масло готовят из сливок, сквашенных с помощью Streptococcus lactis, S. cremoris и Leuconostoccremoris. Образующийся в процессе бро­жения диацетил (см. стр. 289) придает маслу специфический аромат. Закваски, содержащие Streptococcus lactis или Lactobacillus bulgaricus и Streptococcusthermophilus, вызывают свертывание казеина при приго­товлении творога и немецких сыров (гарцского и майнцского). При из­готовлении твердых сыров (в отличие от сыров из кислого молока) для свертывания казеина пользуются сычужным ферментом. Молочно­кислые бактерии (Lactobacillus casei, Streptococcus lactis) вместе с пропио-новокислыми участвуют лишь на стадии созревания сыров. Для приготовления молочнокислых продуктов (табл. 8.3) в качестве заквасок тоже используются стартовые культуры молочнокислых бакте­рий, образующих кислоту и некоторые вещества, придающие продукту характерный запах. Ароматное пахтаньеполучают с помощью упомя­нутых выше заквасок, применяемых для приготовления кисломолочного масла. Пахтанье наряду с молочной кислотой содержит также уксусную кислоту, ацетоин и диацетил. Йогуртполучают из пастеризованного го­могенизированного цельного молока, инокулированного Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus (после внесения закваски молоко выдерживают 2-3 ч при 43-45°С). Под названием биогуртв продажу по­ступает кислое молоко, сквашенное Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus. Кефирпринадлежит к молочнокислым про­дуктам, содержащим кислоты и этанол; его получают из молока (ко­ровьего, овечьего или козьего). Закваску готовят на так называемых ке­фирных зернах, которые состоят из пока еще не полностью изученного сообщества организмов, включающего лактобациллы, стрептококки, микрококки и дрожжи. Сквашивание молока ведут при 15-22°С в тече-   ние 24-36 ч. Для приготовления кумысаиспользуют ослиное молоко1, которое инокулируют культурой, содержащей Lactobacillus bulgaricus и дрожжи рода Torula. Чистую молочную кислоту,которая используется для различных про­мышленных целей и как добавка к пищевым продуктам, получают в ре­зультате брожения. Молоко или сыворотку сбраживают при помощи lactobacillus casei или L. bulgaricus. Для сбраживания глюкозы и маль­тозы применяют L. delbruckii, L. leichmannii или Sporolactobacillus inulinus. Источником необходимых факторов роста служат меласса и солод. Образование кислоты в кислом тесте,используемой для его подъе­ма, тоже обеспечивается молочнокислыми бактериями, в частности Lactobacillus plantarum и L. coryneformis. Стартовые культуры лактоба-цилл и микрококков применяются также для приготовления сырокоп­ченых колбас(салями, сервелат). Образуя молочную кислоту и снижая рН, молочнокислые бактерии предохраняют от порчи те виды колбас, которые не подвергаются варке.

Молочно-кислое брожение представляет собой процесс, столь же важный с хозяйственной точки зрения, как и рассмотренное выше спиртовое брожение.

Молочно-кислое брожение играет определяющую роль при производстве простокваши, кумыса, кефира, сметаны; при квашении капусты, огурцов; силосовании сочных растительных кормов. Очень важна его роль при изготовлении жидких дрожжей, заквасок, кваса.

Важным техническим продуктом является сама, молочная кислота, широко применяемая при производстве фруктовых соков, консервов, в кондитерской, кожевенной, текстильной и других отраслях промышленности.

Все микроорганизмы, способные вызывать молочно-кислое брожение, в зависимости от соотношения получаемых конечных продуктов брожения делятся на две группы — гомоферментативные (типичные) и гетероферментативные (нетипичные).

Гомоферментативные молочнокислые бактерии являются анаэробами или микроаэрофилами. Они неподвижны, спор не образуют, грамположительны, хорошо выносят высушивание (сухие молочно-кислые закваски сохраняются годами). Требовательны к питательной среде, так как многие нуждаются в свободных аминокислотах и других ростовых веществах, в витаминах.

Среди них встречаются палочковидные и кокковые формы. Все они кислотоустойчивы. Палочковидные формы образуют до 2—3 % кислоты, кокковые — до 1—1,2 %. В процессе брожения из сахаров образуют в основном молочную кислоту при самом минимальном количестве побочных продуктов. Суммарное уравнение брожения, вызываемого ими, выглядит следующим образом:

Химизм молочно-кислого брожения сходен со спиртовым. Сбраживанию могут подвергаться как простые моносахара, так и дисахара. Более сложные углеводы перерабатываться не могут, так как молочно-кислые бактерии не имеют ферментов для их расщепления.

В связи с некоторыми различиями в ферментных системах сходство процессов превращения сахаров при молочно-кислом и спиртовом брожениях сохраняется лишь до образования пировиноградной кислоты. Отсутствием у гомоферментативной группы молочно-кислых бактерий ферментов, способных вызывать декарбоксилирование пировиноградной кислоты, объясняется невозможность образования уксусного альдегида. Сама пировиноградная кислота, являясь кетонокислотой, восстанавливается в соответствующую оксикислоту. Восстановление осуществляется ферментом лактикодегидрогеназой. Восстановленная форма кофермента лактикодегидрогеназы (НАДН₂) отдает водород пировиноградной кислоте по следующей схеме:

Наибольший интерес из гомоферментативных возбудителей молочно-кислого брожения представляют следующие.

Молочно-кислый стрептококк — кокки встречаются в молоке и сквашивают его. Газа не образуют. Лучше всего развиваются при температуре 30— 35 °С; в этих условиях молоко свертывается через 10—12 ч, В среде накапливают до 1 % кислоты. Кокки соединены в короткие цепочки или попарно.

Сливочный стрептококк — кокки лучше растут при температуре 25—30 °С. Применяются в заквасках наряду, с предыдущими. Накапливают до 0,8% кислоты. Кокки образуют длинные цепочки.

Болгарская палочка имеет оптимальную температуру роста 40—45 °С. В молоке образует 2,7-* 3,7 % молочной кислоты. Часто образует длинные цепочки.

Ацидофильная палочка имеет температурный оптимум роста 40 °С, В молоке накапливает до 2,2% кислоты. Применяется для производства ацидофильного молока. Способна к слизеобразованию.

Палочка Дельбрюка имеет оптимум температуры развития 45—50 °С. Сбраживает растительные сахара, но совсем не сбраживает молочный сахар — лактозу. Необходима для производства молочной кислоты. Развивается при квашении овощей. Вредит в сахарном и спиртовом производствах. Клетки располагаются поодиночке или в виде коротких цепочек.

Молочно-кислая палочка (бакт. плантарум)—одна из основных культур, развивающихся при квашении овощей, силосовании кормов. Может принимать участие в порче сыров типа Чеддер, вызывая, появление ржавых пятен. Вредит в сахарном и спиртовом производствах.

Сырная палочка имеет оптимальную температуру роста 40—42 °С. Накапливает до 1,5% кислот. Имеет важное значение в сыроделии, принимая участие в созревании Швейцарского и Советского сыров. Участвует в брожении кумыса.

Гетероферментативные молочно-кислые бактерии являются факультативными анаэробами. При брожении, кроме молочной кислоты, в зависимости от видов участвующих бактерий и условий брожения образуют разнообразные вещества — уксусную кислоту, этиловый спирт, а также янтарную кислоту, различные эфиры, углекислый газ, водород, диацетил (вещество, обладающее характерным приятным ароматом) и др. В общих чертах уравнение этого брожения, учитывающее основные конечные продукты, выглядит так:

Участием молочно-киелых гетероферментативных бактерий наряду с дрожжами при выбраживании ржаного теста объясняются значительное накопление молочной и уксусной кислот, этилового спирта, выделение СО₂. При совместном обитании молочно-кислые бактерии оказывают на дрожжи благотворное влияние.

Еще более наглядным примером симбиотического сожительства этих микроорганизмов являются так называемые кефирные зерна, применяемые как закваска при производстве кефира.

Группа гетероферментативных бактерий способна к более глубокому расщеплению белков, чем гомо-ферментативная.

По отношению к температуре среди молочно-кис-лых бактерий различают группу мезофилов, оптимальная температура развития которых 35°С, и труппу термофилов, оптимум температуры для которых около 45 °С. При создании условий, соответствующих требованиям молочно-киелых бактерий, процессы брожения идут с наибольшей скоростью.

Среди гетероферментативных видов молочно-кислых бактерий наиболее важны следующие.

Капустная палочка — возбудитель брожения при сквашивании капусты и огурцов. Образует до 1,2% молочной кислоты. Наряду с другими веществами продуцирует много ароматических веществ, придающих продуктам в процессе сквашивания приятные вкус и аромат.

Ароматообразующие молочно-кислые стрептококки образуют из углеводов заметное количество эфиров и диацетила.

Из нетипичных молочно-киелых бактерий заслуживают внимания также представители рода лейконосток. Это слегка удлиненные кокки размером 0,8— 1 мкм, образующие цепочки или располагающиеся попарно. Часто образуют слизистую оболочку. Термовыносливы— выносят нагревание до 88 °С. Могут принимать участие в порче вин, понижая кислотность и превращая их в сплошную слизистую массу.

Молочно-кислые бактерии из обеих групп способны вызывать порчу и других товаров. Являясь строгими анаэробами или же микроаэрофилами, они усиленно развиваются в упакованных в пленки товарах». Вызывают ослизнение мясных товаров при их вакуумной упаковке. Многие из них вызывают забраживание соков. Являясь довольно термостойкими, в отдельных случаях сохраняются после пастеризации в. молоке и вызывают его порчу. Некоторые представители этой группы способны приживаться в кишечнике человека, играя роль антагонистов гнилостных бактерий. Это их свойство и послужило основанием для гипотезы И. И. Мечникова, согласно которой молочно-кислые бактерии следует использовать в качестве средства борьбы с преждевременной старостью, наступающей в связи с постоянным отравлением человека продуктами жизнедеятельности гнилостных микроорганизмов желудочно-кишечного тракта. Использованная первоначально И. И. Мечниковым для этой цели болгарская палочка оказалась малоустойчивой к кислой среде желудочного сока. В дальнейшем вместо нее получила применение культура ацидофильной палочки, более стойкой, способной приживаться в организме человека. В целом эта гипотеза не разрешила проблемы борьбы с преждевременной старостью. Однако составная ее часть — идея использования антагонизма между микробами — получила признание и широко используется в настоящее время в практике.