Методы лабораторной диагностики

Таксономия, классификация

Шигеллы - кишечные патогены человека и приматов, которые вызывают бактериальную дизентерию или шигеллезы. В соответствии с антигенной структурой О- антигена и биохимическими свойствами известные серотипы шигелл разделяют на четыре вида или серогруппы - S.dysenteriae (серогруппа А), S.flexneri (серогруппа В), S.boydii (серогруппа С) и S.sonnei (серогруппа Д). Наибольшее рас­пространение имеют S. flexneri и S. sonnei.

2. Нозологические формы

Дизентерия - острая кишечная инфекция, которая характеризу­ется поражением дистального отдела толстой кишки с развитием колитического синдрома и общей интоксикацией организма. Выделяют острую дизентерию, хроническую дизентерию, а также колитический или гастроэнтероколитический варианты течения.

Эпидемиология и пути передачи

Бактериальная дизентерия распространена повсеместно. В некоторых регионах шигеллёз остаётся эндемичным и наиболее часто поражает детей в возрасте от 3 мес до 10 лет. Единственный природный резервуар шигелл — человек. Источник инфекции - человек с различными формами клинического проявления шигеллезов или бактерионосители. Основные механизмы передачи — фекально-оральный и контактно-бытовой (через воду, пищевые продукты). Определённую роль играют насекомые-переносчики (мухи, тараканы и др.), переносящие возбудитель на пищевые продукты. Механизм заражения - фекально - оральный. Для различных видов шигелл характерны преобладающие пути передачи (контактно- бытовой - для S.dysenteriae, пищевой - для S.sonnei, водный - для S.flexneri). Для эпидемического процесса характерна изменение структуры циркулирующих популяций возбудителей - смена ведущих видов, биоваров, сероваров, что связано как с изменениями популяционного иммунитета, так и с изменениями свойств возбудителя, особенно с приобретением различных плазмид (R, F, Col и др.). Инфицирующая доза - порядка 200 - 300 шигелл. Более легкое течение имеет дизентерия, вызванная шигеллами Зонне. Дизентерию регистрируют в течение всего года с подъёмом заболеваемости в тёплый сезон. Шигеллы довольно устойчивы во внешней среде: на ткани и бумаге сохраняются до 1 мес, в высохших испражнениях — до 5 мес, в почве — 3–4 мес, в воде — до 15 дней. На овощах и фруктах они остаются живыми не более 2 нед, в молоке и молочных продуктах — несколько недель. При 60°С погибают в течение 15–20 мин, при кипячении — мгновенно. Бактерии очень чувствительны к действию дезинфицирующих средств, содержащих хлор.

Морфологические и тинкториальные свойства

По морфологическим признакам шигеллы не отличаются от остальных энтеробактерий. Это неподвижные факультативно-анаэробные небольшие грамотрицательные палочки с закругленнымиконцами, расположенные беспоря­дочно. Капсул не имеют, спор не образуют.

Питательные среды и культуральные свойства

Не требовательны к питательным средам, чаще используют дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина, Плоскирева). На твёрдых средах образуют гладкие (S-) и шероховатые (R-) колонии. S-колонии круглые, куполообразные, гладкие, полупрозрачные в проходящем свете. R-колонии неправильной формы, плоские, тусклые, с шероховатой поверхностью и неровными краями. В жидких средах S-формы дают равномерное помутнение, R-формы — придонный осадок, среда остаётся прозрачной.

Среда Плоскирева - дифференциально-диагностическая среда_, используемая для первичного посева материала от больных дизентерией. Шигеллы образуют прозрачные бесцветные колонии, т.к. не разлага­ют лактозу.

Антигенная стуктура

Определение антигенной структуры проводят для окончательной идентификации бактерий.У шигелл имеются О- и К- антигены. О- антигены имеют эпитопы различной специфичности - от общих для семейства энтеробактерий до типоспецифических. В классификации учитывают только термостабильные групповые (четыре группы или вида - А, В,С и Д) и типоспецифические (деление на серотипы). К термолабильным антигенам относятся К- антигены (они имеются в группах А и С). Термолабильные Аг (включающие К-Аг, сходный с К-Аг эшерихий) обнаружены у всех шигелл (за исключением бактерий Флекснера и Зонне). Они способны маскировать О-Аг и тем самым блокировать агглютинацию бактерий О-антисыворотками (действие снимают кипячением в течение 1 ч). Термостабильные О-Аг разделяют на типовые и групповые. Соответственно шигеллы разделяют на подгруппы (виды). Серовары и подсеровары обозначают арабскими цифрами (к последним добавляют прописные латинские буквы); серовар-специфичные (типовые) Аг обозначают римскими (I–VI), групповые — арабскими цифрами.

Биохимические свойства

Шигеллы по сравнению с другими кишечными бактериями биохимически малоактивны. Не образуют сероводород на трехсахарно - железном агаре, не ферментируют мочевину.

Наименьшей ферментативной активностью обладают штаммы S.dysenteriae (серогруппа А), ферментирующие только глюкозу без газообразования, в отличие от других шигелл этот вид является маннит - отрицательным.

Шигеллы Флекснера ферментируют маннит, образуют индол, но не ферментируют лактозу, дульцит и ксилозу. Серотип Ньюкасл разделен на три биохимических типа. Для шигелл Флекснера более характерен водный путь передачи.

Шигеллы Бойда (серогруппа С) имеют близкую биохимическую активность, однако ферментируют дульцит, ксилозу и арабинозу. Имеют ряд серотипов, каждый из которых имеет свой главный типовой антиген.

Шигеллы Зонне (серогруппа Д) способны медленно ферментировать лактозу и сахарозу, имеют биохимические типы и фаготипы. Основной путь передачи - пищевой (чаще через молоко и молочные продукты).

Факторы патогенности

Главная биологическая характеристика шигелл - способность внедряться в эпителиальные клетки, размножаться в них и вызывать их гибель. У шигелл имеются ряд факторов, оп­ределяющих их взаимодействие со слизистой оболочкой кишечника. Это ферменты гиалуронидаза, муциназа, нейраминидаза, повышаю­щие проницаемость и способствующие достижению бактериями по­верхности эпителиального слоя стенки кишки.

Шигеллы обладают факторами адгезии и колонизации.Их функ­цию выполняют фимбрии,белки наружной мембраны, ЛПС, с помо­щью которых шигсллы прикрепляются к гликокаликсу микроворсинок эпителия, где и происходит колонизация.

Шигеллы имеют факторы инвазии, представленные белками на­ружной мембраны, и контролируемые генами инвазивных плазмид. Инвазины способствуют проникновению шигелл внутрь клеток. Кро­ме того, у шигелл обнаружен фактор межклеточного распростране­ния, обладающий гемолитическими свойствами. Это белок наружной мембраны, который обеспечивает переход шигелл из одной клетки в другую, вызывая лизис межклеточных мембран.

Все виды шигелл обладают эндотоксином, вызывающим общую интоксикации. У шигелл имеются термолабильные экзотоксины: Шига-токсин (STL-I)проявляет одновременно цитотоксичекие, нейротоксические и энтеротоксические свойства, обладая тропизмом как к нервной системе, так и к слизистой толстого кишечника. Кроме того, Шига-токсин может вызывать гемолитический уремический синдром с развитием почечной недостаточности. Долгое время считалось, что экзотоксином обладает только S. disenteriae серовар I (бактерии Григорьева-Шига), но оказалось, что способностью к продукции Шига-токсина обладают и другие серовары S. disenreriae, а также остальные виды шигелл.

Шигаподобный токсин несколько отличается но антигенным свойствам, имея с Шига-токсином50-60% гомологии, но тем не менее нейтрализуется антителами к токсину STL-I. Этот токсинвызывает нарушение синтеза белка, всасывания ионов натрия и воды, приток жидкости в очаг воспаления. Шигаподобный токсин образуют не только шигеллы, но и некоторые сальмонеллы и диареегенные эшерихии.

Шига-токсин имеет типичную АВ-структуруи состоит из субъединицы А и 5 субъединиц В. В-пентамер присоединяется к колоноцитам через специфические гликолипидные рецепторы и способствует проникновению субъединицы А внутрь клетки, где она распадается на А1 и А2. Субъединица А1 приводит к прекращению синтеза белка на уровне 60S субъединицы рибосомы, последующим цитопатическим изменениям и возможной гибели клетки.

S. flexneri, S. boydii и S. sonnei могут продуцировать LT-энтеротоксины, контролируемые Ent-плазмидами. Таким образом, патогенность шигелл связана с их способностью проникать в клетки эпителия толстой кишки, размножаться в них, переходя из клетки в клетку и приводя к их гибели, с одновременной продукцией эндо- и экзотоксинов.

Патогенез

Взаимодействие шигелл со слизистой оболочкой ки­шечника начинается с адгезии и колонизации пристеночного слоя. Бактерии прикрепляются к рецепторам, имеющимся у эпителиоцитов толстой кишки, что вызывает уплотнение нитей актина и накопление миозина вокруг участка прикрепления. Формируются псевдоподии, происходит захват бактерий и они оказываются внутри фагосомы. За­тем стенка фагосомы лизирустся и шигеллы поступают в цитоплазму, где интенсивно размножатся. Они не обладают подвижностью, но во время размножения на конце бактерии образуется «хвост» из нитей актина, выполняющий роль пропеллера, который помогает бактериям переходить в соседние клетки. Мембраны этих клеток были предвари­тельно лизированы, синтезированным в это же время фактором меж­клеточного распространения гемолизином. Такой процесс многократно повторяется, сопровождается гибелью колоноцитов и спо­собствует распространению шигелл в ткани, развитию воспалитель­ного процесса с изъязвлением эпителия. Воспаление усугубляется действием вырабатываемого шигеллами экзотоксина, обладающего цитотоксическими, нейротоксическими и энтеротоксическими свойства­ми. Его действие приводит к местной гиперсекреции жидкости и развитию диареи, блокирует синтез белка как в колоноцитах тол­стой кишки, так и в нервных клетках, что приводит к их цитопатическим изменениям. Важную роль в патогенезе дизентерии играет эндотоксин, вызывающий лихорадочное состояние, поражение сердечно-сосудистой системы, нервной системы, надпочечников, органов пищеварения. При дизентерийной инфекции часто развивается дисбактериоз, что отягощает ее течение

Дизентерия антропонозная инфекция с фекально-оральным ме­ханизмом передачи. Заражение происходит от больных людей, чаще если у них легкая форма болезни или хроническая дизентерия, а так­же от бактерионосителей. Заболевание распространяется через гряз­ные руки, загрязненные предметы, инфицированные продукты и воду. Это широко распространенное заболевание, болеют люди всех возра­стов, но чаще дети первых лет жизни (1-2 года). Наиболее типичные признаки дизентерии - понос, тенезмы (болезненные спазмы прямой кишки) и частые позывы, общая интоксикация. Характер стула определяется степенью поражения толстого кишечника.

Инкубационный период от 1 до 7 дней. Начало острое. Клиника: повышение температуры до 38 - 39 С, слабость, головная боль, тошнота, рвота, снижение АД; синдром интоксикации более выражен при колитических формах дизентерии. Стул частый (от 5 до 20 раз в сутки), при тяжелом течении - "без счета". Колитический вариант острой дизентерии характеризуется скудным стулом с примесью слизи и прожилками крови, иногда по типу "ректального плевка" - слизь с прожилками крови без каловых масс, а при наличии энтерита обильный; патологические примеси в стуле: слизь и прожилки крови (при катаральном проктосигмоидите крови в стуле нет). Боли в животе локализуются по ходу толстого кишечника, но чаще в области спазмированной сигмовидной кишки, носят спастический характер. При дизентерийном колите характерно наличие ложных позывов на дефекацию, тенезмов (болезненных сокращений ануса после акта дефекации). Синдром дегидратации развивается при гастроэнтероколитическом и гастроэнтеритическом вариантах. Выраженной дегидратации не наступает. Осложнения встречаются преимущественно при тяжелом течении шигеллеза Флекснера в виде инфекционно-токсического шока, кишечного кровотечения, кишечной непроходимости. У абсолютного большинства больных развиваются нарушения микробной экологии кишечника (дисбактериозы).

Иммунитет

После заболевания отмечается развитие местного иммунитета - усиливается синтез лимфоидными клетками слизистой оболочки кишечника SIgА, которые покрывают слизистую оболочку и препятствуют адгезии и проникновению шигелл в эпителиальные клетки. АТ к Аг возбудителя возникают в 1-ю неделюзаболевания, достигая максимального титра на 2-й неделе. Но напряженный иммунитет они не формируют.Иммунитет типоспецифический, нестойкий.

Методы лабораторной диагностики

Основной метод диагностики - бактериологический; применяют также серологический и молекулярно-генетический методы, аллергическую пробу.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал - испражнения, которые берут из судна, отбирая пробы, содержащие слизь и гной, в стерильную пробирку. Нередко материал берут непосред­ственно из верхнего отдела прямой кишки с помощью тампона, про­волочной петли и ректальной трубки. Бактериологическое исследование необходимо проводить в кратчайший срок после взятия материала («у постели больного»), т.к. шигеллы в испражнениях быс­тро погибают. Обычно материал помещают в консервирующую смесь, содержащую физиологический раствор NaCl с глицерином, или в транс­портную среду - селенитовую среду обогащения или среду с желчью. В результате срок исследования продлевается до 24 часов при усло­вии хранения проб в холодильнике.

Схема бактериологического исследования дизентерии

Этапы исследования	Ход исследования	Результат
Предварительный этап	Посев исследуемого материала на жидкую селенитовую среду	Среда помутнела
1-й	Посев исследуемого материала или пересев с селенитовой среды на чашки со средой Левина или Плоскирева для получения изолированных колоний	На среде выросли различные колонии, в том числе лактозонегативные
2-й	Пересев лактозонегативных колоний некомбинированную среду Клиглера или Ресселя уколом в столбик или штрихом по скошенной поверхности. Часть колоний засевают в Api 20 Е тест-систему	Столбиковая часть комбини- рованной среды закислилась, скошенная поверхность имеет нейтральный или щелочной рН
3-й	Идентификация чистой культуры на основании изучения: 1. морфологии – окраска по Граму и препарат «раздавленная капля» 2. учет результатов биохимического тестирования 3.Серологическая идентификация: РА на стекле с поливалентными дизентерийными сыворотками Чувствительность к АБ методом бумажных дисков	1 культура неподвижна, в окрашенном препарате в поле зрения – небольшие грамм- палочки с закругленными концами, расположенные беспорядочно 2.Биохимическая характеристика соответствует……. 3. При положительной реакции агглютинации культура относится к роду шигелл и виду….. Учет чувствительности к АБ
4-й	Учет результатов идентификации по проведенному исследованию	Заключение: из исследуемого материала выделена культура …..чувствительная к АБ……

Серологический метод. Его проводят с целью выявления анти­тел в сыворотке больного при затянувшихся, хронических формах за­болевания, а также для ретроспективной диагностики. Антитела можно выявить с помощью РИГА или развернутой реакции агглютинации («дизентерийный Видаль»). В последнее время рекомендуется в каче­стве основной серологической реакции использовать РСК (также и для обнаружения антигенов).

Антигены шигелл определяют в испражнениях или исследуя ко­лонии, выросшие на чашках с дифференциально-диагностическими средами, в реакциях: РИФ, РИГА, ИФА. КОА (экспресс-методы диагностики). Антигены S. sonnei обнаруживают в пищевых продуктах и в объектах внешней среды, используя «Шигелла-тест» - диагностичес­кую систему для постановки- ИФА.

В трудных для диагностики случаях заболевания иногда приме­няют молекулярно-генетические методы исследования: ПЦР или ген­ное зондирование.

В качестве дополнительного экспресс-метода диагностики у де­тей, особенно при стертых и субклинических формах дизентерии, мо­жет быть использована внутрикожная аллергическая проба с дизентерином.

Лечение и профилактика

Важное значение имеют общие санитарно-гигиенические мероприятия: контроль за источниками водоснабжения, системой общественного питания, производством молока, мяса, магазинами, рынками и т.п. Для специфической профилактики в стадии разработки находится химическая дизентерийная вакцина. В эпидемических очагах можно применять специфический бактериофаг. Лечение проводят антибиотиками широкого спектра действия - тетрациклины и левомицетин при обязательном определении чувствительности, так как распространены антибиотикорезистентные и антибиотикозависимые штаммы. Высокоэффективны химиопрепараты - сульфаниламиды (сульгин, фталазол) и фторхинолоны (ципрофлоксацин, норфлоксацин, ломефлоксацин). Также в большинстве случаев необходимы симптоматическая терапия, восполнение потерь жидкости и электролитов.