МЕТОДЫИССЛЕДОВАНИЯ
Методы исследования можно разделить на две большие группы:
По объекту исследования
По задачам
По объекту исследования:
I. Методы исследования живых клеток и тканей
1. непосредственно в организме (in vivo)
2. в культуре клеток и ткани – в пробирке (in vitro)
3. суправитальное исследование
- суправитальное - исследование живых клеток, выделенных из организма
II. Методы исследования фиксированных клеток и тканей
1. светооптическая микроскопия
2. гистохимическое исследование - выявление в срезах
веществ разной химической природы (ДНК, РНК, гликоген,
импрегнация серебром, эластические волокна и т.д.)
3. иммуногистохимическое исследование – с применением
антител к исследуемым антигенам
4. электронно-микроскопические исследования - исследова-
ние клеточных ультраструктур
По задачам:
I. Качественные методы - выявление структур
Методы:
1. светооптический
2. электронно-микроскопический
3 гистохимический
4 иммуногистохимический
II. Количественные методы – изучение размеров или числа структур
Методы:
1. Морфометрический (количественная электронная микроскопия, количественная гистохимия)
2. иммунофенотипирование
3. цитогенетический
4. авторадиографический
5. ДНК-цитометрия
Светооптический метод (традиционная качественная гистология)
Две части:
1. приготовление гистологических препаратов
2. микроскопия гистологических препаратов
Этапы приготовления гистологических препаратов:
I. врачебные
II. лаборантские
Врачебный этап:
1. забор материала -
- максимально должен отражать изучаемый объект
(столько кусочков, сколько необходимо)
- как можно более свежий
- кусочек не более 1 куб. см
- щадящее - острый инструмент, не сдавливать
2. маркировка
- простым карандашом ФИО, № истории болезни
3. фиксация
- цель – предотвратить разложение ткани
- закрепить прижизненные структуры
- формалин - 10%, нейтральный
- объем фиксатора должен быть в 20-100 раз
больше фиксируемого кусочка
- время фиксации – не менее 12 часов до
нескольких суток (для иммуногистохими
- не более 24 часов)
II. лаборантские
4. проводка материала
а. промывка - отмывают от формалина
- в проточной воде до 1 часа
б. обезвоживание
- обеспечивает проникновение парафина
- проводка по спиртам восходящей крепости до абсолютного спирта (от 60 до 100 градусов)
в. уплотнение - парафиновая заливка материала - заливка в расплавленный до 56 гр парафин
г. формирование блока
- когда парафин застыл, вырезают кусочек ткани
- насаживают на деревянную или пластмас-
Совую основу
Приготовление срезов
- на микротомах
1. санные
2. роторные (серийные срезы)
3. замораживающие (срочные исследования)
Окрашивание среза
красители:
Основные - структуры, ими окрашивающиеся,
Называют базофильными (ядро – гематоксилином в фиолетовый цвет)
Кислые - структуры ими окрашивающиеся
Называются - оксифильными или ацидофильными
(цитоплазма – эозином – розовый цвет)
Специальные
Жир - судан Ш - оранжевый
эластические волокна - орсеином- коричневые
нервная ткань - соли серебра – черная
(импрегнация)
7 заключение среза
задачи:
- сохранение среза, достигается:
- изоляция от внешней среды
- удаление воды (спирты)
реализация:
- капля канадского (пихтового) бальзама
- покровное стекло
Виды микропрепаратов:
1. гистологические срезы тканей органов
2. мазки (кровь человека)
3. отпечатки (с опухоли)
4. пленки (РСТ)
Морфометрия
- метод определения числа и размеров структур
Разновидности:
1. ручная морфометрия
2. автоматизированная морфометрия
Виды морфометрических исследований:
1. подсчет индексов
2. измерение размеров структур
Индексы:
а. митотический индекс (ИМ) - число митозов на 100 (1000) клеток
б. индекс меченых ядер (ИМЯ)– при радиоавтографии – % клеток, включивших исследуемое вещество, меченное радиоизотопной меткой
г. статмокинетический индекс (СКИ) - накопление митозов в течение определенного времени после разрушения веретена деления (колхицин)
в. индекс апоптоза – частоты гибели клеток
Измерение размеров структур
1. окулярной микролинейкой (или окуляр-микрометра)
- позволяет получать абсолютные значения размеров
структур
- в мкм
2. морфометрических сеток
- позволяет определять относительные показатели –
долю объема, занимаемую структурой в срезе
- в %
Автоматизированные системы обработки изображений
Состоят из трех частей:
1. воспринимающая часть - сканирующий микроскоп
2. регистрация сигнала – фотометрический (ФЭУ) или видеокамера
3. ЭВМ (электронно-вычислительная машина) – цифровые массивы или гистограммы распределения изучаемого признака.
Задачи:
1. Морфометрическая - оценка морфометрических показателей (количество объектов в определенной площади среза, размеры объектов, отношения показателей). Регистрация сигнала - видеокамера.
2. Денситометрическая - оценка количества вещества в структуре (содержания ДНК в ядре клетки и т.д.). Регистрация сигнала – фотоэлектронный умножитель.
Пример морфометрической задачи - изучение ядерно-цитоплазматического отношения.
Ядерно-цитоплазматическое отношение –
- относительный показатель
- отношение объема (размера) ядра клетки к объему
(размеру) ее цитоплазмы
- является величиной постоянной (константой) для
каждого вида ткани
- константа достигается после окончания процесса
дробления в эмбриогенезе (процесс дробления
осуществляется до достижения клетками данной
ткани определенного ядерно-цитоплазматического
отношения, после чего начинается деление клеток
путем митоза)
- анализ показателя возможен только в пределах
одного вида клеток – т.е. невозможно сравнивать между собой лимфоциты и гепатоциты
Задачи исследования ядерно-цитоплазматического отношения:
1. оценка константы данной ткани
- лимфоциты – высокое ядерно-цитоплазматическое отношение (приближается к единице – малые лимфоциты – 0,9; средние – 0,7)
- гепатоциты – низкое ядерно-цитоплазматическое
отношение (0,45-0,55)
2. оценка функционального состояния клеток одной ткани
а. нормофункция - ядерно-цитоплазматическое
отношение, характерное для данной ткани,
константа – так в щитовидной железе тироциты
стенки фолликулов – однослойный кубический
эпителий
б. гиперфункция - сопровождается клеточной
гипертрофией – увеличением клеточных разме- ров за счет объема цитоплазмы, т.к. не происходит
изменений количества ДНК в ядре, а значит и
его размеров. Т.о. при гиперфункции ядерно-
цитоплазматическое отношение снижается,
становится более низким.
в. гипофункция - сопровождается клеточной
гипотрофией - атрофией - уменьшением
размеров клеток. При этом ядерно-цитоплаз- матическое отношение увеличивается.
Т.о. увеличение ядерно-цитоплазматического отноше-
ния в ткани свидетельствует о развитии гипофункции, а уменьшение - о
гиперфункции ее клеток.
Проточная цитометрия
- метод количественного анализа клеток в потоке несущей жидкости с
использованием проточных цитометров.
Основные принципы метода:
1. из ткани получают клеточную суспензию, состоящую из отдельных клеток
2. клетки обрабатывают веществами, количественно связывающимися с определенными клеточными структурами:
1. антитела – на белки в клеточной поверхности
2. ДНК-зонды
3. РНК-зонды и т.д.
3. использование флуоресцентной метки, присоединяемой к получаемому комплексу
4. выстраивание клеток в потоке жидкости в один ряд, в одну линию
5. возбуждение флуоресцентных меток на клетках энергией лазера
6. измерение интенсивности люминесценции метки ФЭУ
7. обработка полученных результатов на ЭВМ
8. результаты исследований представлены в виде гистограмм распределения и вариационных рядов цифровых значений
Варианты:
1. количественная гистохимия
- измерение количества веществ в клетке с помощью
проведения химических реакций
- пример – ДНК-цитометрия
2. иммунофенотипирование
- выявление комплекса антиген-антитело
ДНК-цитометрия
- изучение количества ДНК в ядрах клеток
Задачи:
1. оценка уровня активности пролиферативных процессов в ткани
2. распределение ядер клеток по плоидности
3. определение временных параметров клеточного цикла
4. выявление состояний анэуплоидии – отличающегося от нормального содержание ДНК
Окраска:
Люминесцентный краситель в реакции по Фельгену
Результаты исследования:
В виде ДНК-гистограмм - распределение изучаемых клеток по содержанию в их ядрах ДНК.
Три группы клеток:
1. диплоидные - содержание ДНК - 2с (хромосом – 2n)
2. промежуточные - 2с-4с
3. тетраплоидные - 4с
Т.о., клетки с определенным содержанием ДНК распределяются по периодам клеточного цикла следующим образом:
2с - характеризуют количество клеток в Go и G1 периодах
2с-4с - количество клеток в синтетическом периоде
4с - количество клеток в G2 и М-периодах цикла
Расчет величины пролиферативного пула клеток:
Клетки:
1. синтетическом,
2. премитотическом
3. митотическом периодах цикла
- чем выше его величина – тем выше скорость обновления ткани
наименьшая (стремиться к нулю) - в нейронах
наибольшая - гемопоэтическая и эпителий слизистой
пищеварительной трубки (до 50%)
Временные параметры митотического цикла:
- время прохждения периодов цикла
G1 – период - 3-10 часов
S - период - 7-10 часов
G2 – период - 2-3 часа
М- период - около 1 часа
Gо – период
А. всю клеточную жизнь - нейроны
Б. несколько часов - стволовые клетки
Иммунофенотипирование
- метод качественного и количественного определения наличия
исследуемых антигенов в клетках
Задачи:
1. изучение наличия на поверхности или внутри клеток рецепторных белков - антигенов
2. определение количества клеток, имеющих (экспрессирующих)
этот рецептор в исследуемой популяции
3. определение количества рецепторов на поверхности клеток
4. определение сочетания нескольких рецепторов на поверхности одной клетки (коэкспрессия)
Окраска:
Моноклональные антитела, меченные люминесцентной меткой
Моноклональные антитела позволяют выявлять дифференцировочные антигены на гемопоэтических клетках крови у человека и имеют маркировку CD (cluster of differentiation) - кластер дифференцировки:
Практическое использование:
1. исследование клеточного иммунитета
2. оценка гемопоэза
Исследование клеточного звена иммунитета у человека:
CD3 - Т-лимфоциты - норма в крови взрослого - 67-76%
CD3,CD4 - Т-хелперы - 38-46%
CD3,CD8 - Т-супрессоры - 31-40%
Соотношение хелперы/супрессоры - 1-1,5
(при СПИДе – соотношение снижается меньше 1)
CD19 - В-лимфоциты - норма - 11-16 %
CD16 - макрофаги
CD38 - плазмоциты
2. оценка гемопоэза:
- 1-4 классы зрелости – морфологически нераспознаваемые
- распознавание – иммунологическое – иммунофенотипирование
- суть метода
- часть рецепторных белков сохраняются в клетке всегда, они характеризуют тип кроветворения – лимфоидное, миелоидное и линию – Т- и В- лимфоциты
– при созревании клеток одни рецепторные белки на поверхности появляются, а другие исчезают
Иммуногистохимия
- метод качественного определения антигенов в клетках и тканях на гистологических срезах
Задачи метода:
1. определение гистогенетического типа исследуемой ткани
2. определение иммунофенотипа клеток
3. оценка процессов пролиферации (Ki-67, PCNA) и апоптоза (СD 95) в ткани
4. определение наличия рецепторов к гормонам
5. определение ростовых факторов (IL 1-16)
6. выявление онкопротеинов (р21, р53, N-MYC и т.д.)
7. определение типов коллагена (I, II, IY типа)
8. микробиология/вирусология (гепатиты В и С, цитомегаловирус, герпес и т.д.)
Окраска:
Моноклональные антитела
Определение гистогенетического типа клеток тканей:
- основано на выявлении белков промежуточных филаментов, специфичных для клеток определенных тканей
1. эпителиальные ткани - выявляется кератин (Кeratin)
2. соединительные ткани - виментин (Vimentin)
3. нервная ткань - S100 protein
4. мышечные ткани - десмин (Desmin)
5. лимфоидная и миелоидная ткани - общий лейкоцитарный антиген (LCA)
Цитогенетический метод
- метод качественного и количественного анализа хромосом человека
Актуальность:
1. шесть из 1000 детей рождаются с различными хромосомными нарушениями
2. увеличение возраста матерей - критический возраст матери, после которого вероятность рождения больного ребенка резко возрастает – 35 лет
3. диагностика опухолевых заболеваний, учет при выборе тактики лечения и определение прогноза заболевания
Принцип метода:
- т.к. анализ осуществляется на хромосомах, а последние возможно наблюдать во время митоза то:
1. исследуемые клетки обрабатывают веществом,
стимулирующим митотическую активность -
фитогемагглютинином (ФГА) в условиях in vitro
2 накопление числа метафазных пластинок – в результате разрушения веретена деления - колхицин
3 отбор метафазной пластинки, где хромосомы не
наслаиваются, не наползают друг на друга
4. раскладка хромосом
5. анализ