ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Кафедра Клинической лабораторной диагностики
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ДЛЯ ОБУЧАЮЩЕГОСЯ
К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ ДЛЯ АУДИТОРНОЙ РАБОТЫ
Тема: Методы исследования тромбоцитарного гемостаза.
Утверждена на кафедральном заседании
№ протокола _________-
«_»__________________2009 г
Зав. Кафедрой клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО КрасГМА Росздрава
К.м.н. доцент ________________Анисимова Е.Н.
Составитель:
Асс. кафедры________________Савченко Е.А.
Красноярск
Методические указания к практическому занятию «Методы исследования сосудисто-тромбоцитарного гемостаза »
Тема: Методы исследования сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.
Практическое занятие для цикла профессиональной переподготовки
Значение темы (актуальность изучаемой проблемы).
Остановка кровотечения при повреждении стенки сосуда начинается с сосудисто-тромбоцитарных реакций. Важность биохимических и молекулярных процессов, которые развиваются в ходе осуществления тромбоцитарного гемостаза не вызывает сомнения. Без понимания механизма гемостатических реакций невозможно адекватно интерпретировать результаты исследований при патологии.
3. Цели обучения:
на основе теоретических знаний и практических умений обучающийся должен знать:
o Различные методы подсчета тромбоцитов
o Методы определения времени кровотечения
o Способы оценки функциональной активности тромбоцитов, типы агрегометров
Уметь провести:
- подсчет тромбоцитов в камере Горяева с использованием фазового контраста
- агрегацию тромбоцитов на стекле с различными индукторами (АДФ, ристомицин)
o Работать автоматическими и стеклянными пипетками
o Работы на фазово-контрастном микроскопе
o Оценить агрегатограммы, предоставленные преподавателем, уметь анализировать гиперагрегационный синдром, тромбоцитопатию.
4. План проведения занятия:
1. Контроль исходного уровня знаний, умений
2. Самостоятельная работа курсантов: подсчет тромбоцитов в камере Горяева, исследование агрегации тромбоцитов на стекле
3. Итоговый контроль знаний – тест-контроль по теме занятия
4. Подведение итогов занятия
Самостоятельная работа.
Подсчет тромбоцитов в камере Горяева с использованием фазового контраста; агрегация тромбоцитов на стекле с различными индукторами
Вопросы для самоподготовки обучающихся.
Ø Оценка различных методов определения количества тромбоцитов (в мазке по Фонио, в камере Горяева с фазовым контрастом, гематологические анализаторы).
Ø Особенности подсчета тромбоцитов на гематологических анализаторах, основные причины ошибок
Ø Характеристика параметров тромбоцитов: MPV,PDW,PCT
Ø Характеристика методов определения длительности кровотечения, причины возможных ошибок
Ø Какие приборы используются для оценки функциональной активности тромбоцитов.
Ø Определение агрегации тромбоцитов в цельной крови – импедансные агрегометры.
Ø Диагностика тромбоцитопатий, алгоритм исследования.
Ø Влияние лекарственной терапии на функцию тромбоцитов.
4.3. Итоговый контроль. Тестовые задания по теме:
Основные понятия и положения темы (наглядные формы – таблицы, схемы, алгоритмы)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ТРОМБОЦИТОВ В КРОВИ
Микроскопический метод подсчета
Чаще всего используется метод подсчета тромбоцитов в счетной камере Горяева микроскопией при фазовом контрасте, т.е. с фазово-контрастной приставкой. Мало точен и не может быть рекомендован метод подсчета тромбоцитов в мазке крови.
В настоящее время все шире используются определение количества тромбоцитов и их распределение по величине (гистограмма) с помощью автоматических счетчиков крови. Эти аппараты точны и позволяют проводить экспресс-диагностику (определения выполняются за 1 мин).
Принцип. Производится подсчет тромбоцитов в камере Горяева с применением в качестве разводящей и гемолизирующей жидкости раствора оксалата аммония. При подсчете используют фазово-контрастную микроскопию.
Реактивы. 1% раствор оксалата аммония.
Ход определения. Исследование можно проводить как в крови, полученной из пальца, так и в стабилизированной цитратом венозной крови. В последнем случае полученный при подсчете результат умножают на коэффициент 1,1 (учитывают разведение венозной крови раствором цитрата натрия - 9:1).
Разведение крови. Самым удобным и достаточно точным является способ разведения крови в пробирках (не в меланжере). Для этого, в предварительно высушенную чистую силиконированную или пластиковую (полистирол) пробирку пипеткой отмеривают 1,98 мл 1% оксалата аммония и осторожно вносят в нее 0,02 мл крови. В течение 1-2 мин содержимое пробирки тщательно перемешивают без вспенивания. Заполняют две камеры Горяева и на 10-15 мин помещают их для оседания тромбоцитов во влажную камеру (чашку Петри со смоченной фильтровальной бумагой или марлей). В каждой камере подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах.
Фазово-контрастная микроскопия проводится при помощи обычного микроскопа, осветителя типа ОИ-19 (или аналогичного) и устройства для наблюдения методом фазового контраста КФ-1 или КФ-4.
Подготовка микроскопа. После установки на микроскопе фазовых объективов и фазового конденсора производят фокусировку объективов 40х на сетке камеры Горяева. Устанавливают освещение и центрируют изображение фазовой пластинки и кольцевой диафрагмы. Микроскопию проводят с зеленым светофильтром. При работе с фазово-контрастной установкой необходимо пользоваться камерами одного типа, так как фокусировка оптических систем зависит от толщины стекла камеры.
Расчет определения числа тромбоцитов в 1 мкл крови. Среднюю арифметическую величину из двух параллельных определений умножают на 1000 (площадь 25 больших квадратов - 1 мм2, высота камеры - 0,1 мм, разведение 1:100; следовательно, количество тромбоцитов должно быть умножено на1 х10х100 = 1000).
Нормальные пределы колебаний числа тромбоцитов в крови у человека составляют от 170 до 350 х 109/л. Ошибка метода ± 6,5%.
Подсчет тромбоцитов в крови и определение их размера в мазке - важная часть диагностики тромбоцитопений, эссенциальной и полицитемической тромбоцитемии, ДВС-синдрома, тромботической тромбоцитопенической пурпуры и других микротромбоваскулитов, нарушений гемостаза при аутоимунных формах патологии (СКВ, антифосфолипидном синдроме и др.) и при гепатолиенальном синдроме. При наследственных тромбоцитопатиях наблюдаются формы с микроцитозом (синдром Вискотта-Олдрича) и преобладанием гигантских форм кровяных пластинок (аномалии Бернара-Сулье и Мей-Хегглина), а также формы без изменения размеров этих клеточных элементов.
5.2. Подсчет тромбоцитов на гематологическом анализаторе.
На сегодняшний день методом выбора при исследовании тромбоцитов является их определение на автоматическом анализаторе. Автоматические счетчики позволяют получать достаточно надежные результаты при определении количества тромбоцитов.
При подсчете тромбоцитов по Фонио коэффициент вариации находится в пределах 20%, в камере Горяева - составляет 7-10%, тогда как автоматический подсчет воспроизводится с точностью до 2-4%.
Современные анализаторы сигнализируют о выходе количества тромбоцитов за референтные пределы, наличии агрегатов тромбоцитов, макротромбоцитов или других элементов, сравнимых по объему с тромбоцитами (микроэритроциты), что существенно облегчает трактовку получаемых результатов.
В то же время следует иметь в виду, что в отличие от ручного подсчета тромбоцитов, где проводится предварительный лизис эритроцитов, автоматические счетчики крови анализируют тромбоциты и эритроциты в одной камере без предварительной обработки. Тромбоциты распознаются по размерам в диапазоне 2-20 фл. Это создает проблему дифференцирования больших форм тромбоцитов (макротромбоцитов) и сравнимых с ними по объему эритроцитов (микроцитов), их фрагментов (шизоцитов), а также отшнуровавшихся фрагментов цитоплазмы лейкоцитов (клеточный дебрис).
Ложное занижение числа тромбоцитов может быть при их агрегации, агглютинации под действием тромбоцитарных агглютининов и при прилипании тромбоцитов к лейкоцитам (тромбоцитарный «сателлитизм»). При подсчете на гематологических анализаторах в качестве антикоагулянта используется ЭДТА. При наличии аутоантител к тромбоцитам калиевая соль ЭДТА инициирует агрегацию тромбоцитов, что проявляется псевдотромбоцитопенией.
Нормальные величины. Количество тромбоцитов у здоровых людей составляет 170 - 350 х 109/л.
Клиническое значение
Снижение количества PLT в крови - тромбоцитопения - может развиваться в результате снижения продукции PLT:
· наследственные: синдром Франкони (Фанкони), врожденная тромбоцитопения, краснуха новорожденных;
· приобретенные: лейкозы, миелодиспластические синдромы, миелофиброз, метастазы новообразований в костный мозг; дефицит витамина В12 и фолиевои кислоты (мегалобластные анемии), ночная пароксизмальная гемоглобинурия, вирусные инфекции, интоксикации, наследственные аномалии, ионизирующее облучение, прием миелодепрессивных препаратов, циклическая тромбоцитопения, почечная недостаточность. в результате повышения деструкции PUT: инфекции (значительное, иногда катастрофическое снижение PLT, наблюдается при Конго-Крымской геморрагической лихорадке), эклампсия беременных, гемолитико-уремический синдром (ГУС), ВИЧ-инфекция, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, системная красная волчанка, хронический лимфолейкоз, хронический активный гепатит, посттрансфузионная тромбоцитопения; гемодиализ, кровотечения, разрушение в селезенке (гиперспленизм при болезнях накопления, лимфомах, волосатоклеточном лейкозе, миелопролиферативных заболеваниях, портальной гипертензии);
· в результате потребления PLT: синдром ДВС.