Принцип метода
Тромбоциты способны агрегировать под воздействием различных субстанций, называемых индукторами (стимуляторами) агрегации (АДФ, адреналин, арахидоновая кислота, тромбин, кальциевый ионофор А23187, коллаген, фибрин-мономер, бычий коагуляционный фактор VIII, ристоце-тин и др.). Изучение агрегационной функции тромбоцитов осуществляют при помощи специального прибора - агрегометра. В основе записи агрегатограммы этим прибором — принцип Борна, который предполагает графическую регистрацию выраженности уменьшения оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы в процессе агрегации тромбоцитов. В случае нарушения агрегационной функции тромбоцитов происходит незначительное изменение оптической плотности, что и регистрирует этот прибор.
Забор крови и подготовка плазмы для исследования
После пункции локтевой вены самотеком кровью наполняют пластиковую или силиконированную пробирку, в которую предварительно добавлен раствор цитрата натрия (соотношение объемов крови и цитрата натрия равно 9:1). Затем пробирку тщательно и аккуратно (без встряхивания) перемешивают в течение 2-3 минут.
Материалом для исследования является богатая тромбоцитами плазма.
БТП получают в два этапа. На первом этапе получают богатую тромбоцитами плазму, для чего цитратную кровь центрифугируют в течение 7 минут при 240 g. На втором этапе богатую тромбоцитами плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют в течение 15 минут при 1200-1400 g.
Реактивы и оборудование
0,11 М раствор цитрата натрия (Na3C6H507).
Агрегометр с компьютером и принтером.
Стимуляторы агрегации (АДФ, адреналин, коллаген и др.). В табл. 12 представлены оптимальные конечные концентрации наиболее распространенных стимуляторов агрегации тромбоцитов.
Таблица. Оптимальные конечные концентрации стимуляторов агрегации тромбоцитов
| Индукторы тромбоцитарной агрегации | Конечные концентрации индукторов |
| АДФ | 5-10µМ |
| Адреналин | 10µМ |
| Коллаген | 2-5 ug/ml |
| Арахидоновая кислота | 0,5 mM |
| Ристоцетин | 1,25-1,50 mg/ml |
| Ристоцетин для диагностики 2В типа болезни Виллебранда | 0,25 mg/ml |
Для проведения анализа предварительно необходимо подсчитать число тромбоцитов на гематологическом анализаторе или микроскопическим методом.
Ход определения
Материалом для исследования является богатая тромбоцитами плазма, но для калибровки прибора необходима еще и бедная тромбоцитами плазма.
Поскольку при разном числе тромбоцитов необходимы разные концентрации индукторов агрегации, следует приготовить богатую плазму с одинаковым числом тромбоцитов для всех образцов (исследуемых и контрольных). Для стандартизации числа тромбоцитов следует развести богатую тромбоцитами плазму бедной таким образом, чтобы число тромбоцитов стало равным 150-300 х 109. Например, число тромбоцитов 600 х 109, поэтому исследуемую богатую тромбоцитами плазму необходимо развести бедной тромбоцитами плазмой этого же больного в 2 раза. Таким образом, на первом этапе исследования очень важно определить число тромбоцитов.
Для записи агрегатограммы любому агрегометру необходимо определить оптическую плотность и ряд других параметров в исследуемых образцах, поэтому компьютерный алгоритм агрегометра будет требовать установить в измерительные гнезда пробирки с бедной и богатой тромбоцитами плазмами.
В кювету агрегометра вносят 0,3 мл богатой тромбоцитами плазмы (со стандартным числом тромбоцитов 150—300 х 109), инкубируют пробирку в гнезде для измерения в течение 60—120 с для нагрева богатой тромбоцитами плазмы до 37 °С, затем включают магнитную мешалку, добавляют 0,015 мл раствора индуктора агрегации. В момент добавления индуктора агрегации включают запись регистрации агрегации*.
Оценка результатов исследования
Существует много способов оценки агрегатограмм, но наиболее информативно измерение степени агрегации и угла наклона, поскольку неплохую воспроизводимость демонстрируют именно эти показатели. Их нормальный диапазон зависит от большого числа причин (марки агрегометра, используемых реагентов, числа тромбоцитов, конечной концентрации индуктора, скорости вращения магнитной мешалки и многих других), поэтому общепринятых диапазонов нормы при измерении агрегационной функции тромбоцитов нет. Это вынуждает врачей-лаборантов уточнять нормативы самостоятельно.
Применение низких концентраций стимуляторов агрегации дает возможность оценить раздельно первую и вторую волны агрегации. Большую ценность имеет информация о наличии или отсутствии второй волны агрегации, поскольку именно вторая волна на агрегатограмме отражает реакцию высвобождения содержимого тромбоцитарных гранул (плотных и а-гранул). Весьма полезно при записи агрегации тромбоцитов использовать несколько стимуляторов агрегации. При наличии геморрагического синдрома и отсутствии нарушений агрегации тромбоцитов необходимо повторно выполнить исследование через 1—1,5 месяца. И наоборот, при наличии специфичных изменений агрегации для болезни Бернара-Сулье, тромбастении Гланцманна и другой патологии необходимо повторно исследовать агрегационную функцию тромбоцитов.
Причины ошибок
Тест очень чувствителен к дефектам преаналитического этапа. Даже минимальный недостаток цитрата натрия вследствие низкого гематокрита ведет к значительным погрешностям и невоспроизводимым результатам.
Последовательность манипуляций и объемы смешиваемых реагентов могут отличаться для разных типов агрегометров.
Для исследования агрегации необходимо использовать специальные иглы для пункции кубитальной вены, которые способны наполнить кровью пробирки с цитратом натрия самотеком. Забирать кровь шприцом нельзя.
Некачественная обработка магнитных мешалок и пробирок ведет к грубым ошибкам. Существенную помощь в обработке лабораторной посуды оказывают ультразвуковые мойки.
Неточный замер прибором оптической плотности богатой и бедной тромбоцитами плазмы также приводит к ошибкам. Подобный дефект возможен при наличии царапин на пробирках.
Неточное определение числа тромбоцитов и, как следствие, исследование образца плазмы с нестандартным числом тромбоцитов является причиной ошибок.
Варианты результатов записи агрегации тромбоцитов методом Борна при различных вариантах нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.
| Патология гемостаза | АДФ | Арахи-доновая кислота | Коллаген | Адреналин | Ристоцетин |
| Тромбоцитопатия | Норма или снижение* | Норма или снижение* | Норма или снижение* | Норма или снижение* | Норма |
| Влияние аспирина или других нестероидных противовоспалительных препаратов | Норма или снижение (часто умеренное) с нарушением второй волны | Отсутствие или значимое снижение | Норма для концентрации 5 ug/ml или снижение для концентрации 2 ug/ml | Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегато- грамме | Норма или умеренное снижение |
| Нарушение пула хранения | Норма или снижение (часто умеренное) с нарушением второй волны | Норма | Норма | Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегато-грамме | Норма |
| Синдром Бернара-Сулье | Норма | Норма | Норма | Норма | Отсутствие или значимое снижение |
| Нарушение реакций высвобождения (секреции) из тромбоцитарных гранул | Норма или снижение (часто умеренное) с нарушением второй волны | Норма | Норма | Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегато- грамме | Норма |
| Тромбастения Гланцманна | Отсутствие | Отсутствие | Отсутствие | Отсутствие | Норма |
| Болезнь Виллебранда | Норма | Норма | Норма | Норма | Отсутствие или значимое снижение (иногда норма при 2N, повышение при типе 2В) |
*
При тромбоцитопатиях может быть нарушена агрегация с одним (обуславливая так называемую парциальную тромбоцитопатию) или разными индукторами агрегации.
Иногда диагностические трудности возникают при дифференциальной диагностике болезни Виллебранда и болезни Бернара-Сулье, поскольку варианты нарушений при исследовании агрегационной функции тромбоцитов при этих состояниях одинаковы. В этом случае помогает добавление в исследуемую богатую тромбоцитами плазму нормальной БТП или крио-преципитата. Эта простая модификация восстанавливает ристомициновую агрегацию у больных с болезнью Виллебранда, но не исправляет нарушение агрегации при болезни Бернара-Сулье.
13. Список литературы по теме занятия:
- Основная
• Долгов, В.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза / В.В. Долгов, П.В. Свирин. М., 2005.–115 с.
• Баркаган З.С.Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза/З.С. Баркаган, А.П. Момот.-Москва: Ньюдиамед.-2001, 285с. с ил.
• Момот А.П. Патология гемостаза / А.П. Момот.-СПб.:ФормаТ.-208с
Дополнительная
• Тимошевский В.И. Носовые кровотечения / В.И. Тимошевский, А.Н. Мамаев.-Тверь: ООО «Издательство «Триада»,2007.-120с.
Учебно-методическое пособие:
Каталог наборов реагентов НПО «РЕНАМ» МБООИ «Общество больных гемофилией»