Смесь веществ, подвергаемая разделению на гель-фильтрационной колонке, состоит из трех компонентов: голубого декстрана, цитохрома с и хромата калия. Их основные свойства приведены в таблице 3.
Таблица 3. Основные свойства разделяемых веществ.
| Название соединения | Мол. масса, кДа | Цвет соединения | Максимум оптического поглощения, нм | Класс соединений |
| Голубой декстран* | ~ 2000 | Голубой | полисахарид, конъюгированный с красителем | |
| Цитохром с ** | ~12,3 | Коричневый | белок | |
| Хромат калия (К2CrO4) | 0, 194 | Желтый | Нет явно выраженного максимума | неорганическая соль |
* - полисахарид, состоящий из остатков глюкозы, сшитых 1,6- и 1,3-гликозидными связями, и конъюгированный с красителем реактивным голубым 2;
** - гем-содержащий белок, компонент электрон-транспортной цепи.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ (работа в паре)
В основе данной практической работы лежит задача, в течение многих лет предлагаемая студентам на Малом практикуме по биохимии под руководством Г.А. Соловьевой.
Реактивы:
1. Сефадекс G-75
2. 0,9% раствор NaCl (элюирующий раствор) – 250 мл
3. Смесь разделяемых веществ – 0,7 мл
а) голубой декстран - 4 мг/мл
б) цитохром с – 3 мг/мл
в) хромат калия K2CrO4 – 1,5 мг/мл
Оборудование:
1. Колонка (1,5 х 30 мл) на штативе со шлангами
2. Перистальтический насос
3. Стакан для элюирующего раствора или склянка с нижним тубусом
4. Стакан на 50 мл для сефадекса
5. Стакан на 100 мл для элюата
6. Мерные пробирки на 15 мл (20 шт.) в штативе
7. Спектрофотометр
8. Кюветы пластиковые на 1 мл с длиной оптического пути 1 см
9. Стеклянная палочка
10. Фильтровальная бумага
11. Автоматическая пипетка 0,1-1 мл
12. Шприц на 10 мл
1. Заполнение колонки.
Для успешного разделения исследуемых веществ большое значение имеет правильное заполнение колонки.
1) Укрепите колонку в штативе строго вертикально.
2) Закройте снизу кран и заполните колонку водой примерно на 1/3 объема. С помощью шприца освободите пространство под пористым диском от пузырьков воздуха.
3) Через воронку или по палочке заполните колонку густой суспензией тщательно взмученного сорбента (Сефадекс G-75) так, чтобы его конечный объем составил ~45 мл (считаем, что объем колонки равен ~ 45 мл). Подумайте, какими способами можно точно определить, до какого уровня необходимо залить суспензию сорбента в колонку, чтобы его объем составил 45 мл, если диаметр данной колонки 1,5 см.
4) Дайте суспензии осесть и при необходимости добавьте еще порцию сорбента, взмутив стеклянной палочкой верхний слой уже осевшего носителя и открыв колонку снизу. Чтобы во время хроматографии верхний слой сорбента не взмучивался, на него можно положить кружок из фильтровальной бумаги.
5) Плотно закройте крышку колонки так, чтобы колонка была полностью герметична.
6) Подсоедините колонку к перистальтическому насосу (или к склянке с нижним тубусом), с помощью которого вы будете задавать скорость тока жидкости через колонку, и пропустите небольшой объем элюирующего раствора, чтобы сорбент слегка уплотнился и его объем перестал изменяться.
7) Определите скорость тока жидкости через колонку. Оптимальная скорость для данного разделения (при диаметре колонки 1,5 см) – 20-25 мл/ч. Убедитесь, что ваша колонка выдерживает такую скорость (уровень жидкости и сорбента в колонке должны быть постоянными).
Основные требования к работе с гель-фильтрационной колонкой:
-в носителе не должно быть пузырей воздуха
-не допускайте резких перепадов давления
-не пересушите гель
-при любых действиях с колонкой предварительно закрывайте нижний кран.
2. Нанесение белка на колонку.
1) Выключите перистальтический насос, закройте кран внизу колонки и откройте крышку.
2) Аккуратно автоматической пипеткой отберите жидкость над верхним слоем сорбента (над фильтровальной бумагой) или дайте ему впитаться, открыв кран снизу. Следите за тем, чтобы верхний слой сорбента при этом не пересох (оставьте 2-3 мм слоя жидкости). Закройте кран.
3) Нанесите на колонку 0,7 мл смеси разделяемых веществ круговыми движениями по внутренним стенкам колонки с помощью автоматической пипетки.
4) Дайте смеси впитаться, открыв кран снизу. С этого момента начинайте собирать элюат в мерную пробирку (пробирка №1).
5) Закройте кран. Наслоите элюирующий раствор (1,0-1,5 мл) на сорбент, обмывая стенки колонки, и снова дайте ему впитаться. Элюат собирайте в ту же мерную пробирку. Пробирки пронумеруйте.
6) Еще раз наслоите 1,0-1,5 мл элюирующего раствора на сорбент, закройте колонку, подключите ее к перистальтическому насосу и продолжайте элюцию со скоростью 20-25 мл/ч. В пробирку №1 соберите ~7 мл элюата (практически до начала элюции голубого декстрана). Далее элюат фракционируйте в мерные пробирки по 2 мл (при определении объема фракций элюата мениск должен находиться на уровне глаз). Сбор фракций заканчивайте после «выхода» хромата калия, но колонку продолжайте промывать элюирующим раствором, чтобы отмыть гель от неспецифически сорбированных на нем веществ. В идеале нужно пропустить через колонку 2-3 объема элюирующего раствора.
Практически сразу после начала элюции видно, что на колонке начинается разделение нанесенной смеси веществ.
3. Построение профиля элюции веществ, разделенных в результате гель-хроматографии.
1) Для построения профиля элюции измерьте величину оптического поглощения полученных в результате хроматографии фракций на спектрофотометре. Фракции голубого декстрана спектрофотометрируйте при 670 нм (А0,1%620 нм = 0,89-0,95), а фракции, содержащие цитохром с и хромат калия – при 425 нм. (Подумайте, почему оптическое поглощение предлагается измерять при этих длинах волн, а не в максимумах поглощения голубого декстрана и цитохрома с). Объем пластиковой кюветы – 1 мл, длина оптического пути – 1 см. В качестве контрольного раствора используйте элюирующий раствор.
2) Данные измерения оптической плотности внесите в таблицу 4 и постройте по ним профиль элюции разделяемых веществ – зависимость величины оптического поглощения, пропорционального концентрации вещества в пробе, от объема элюции.
3) По профилю элюции определите величины Vo, Ve и Vi, где Vo – объем элюции голубого декстрана, Ve1 – объем элюции цитохрома с, а Ve2 = Vi – объем элюции хромата калия.
4) Отметьте на колонке маркером уровень геля. Закончите промывку геля в колонке. С помощью шприца выбейте гель из колонки в стаканчик. Определите общий объем Vt колонки. (Это можно сделать двумя способами. Предложите, какими).
5) Рассчитайте величину Kav для цитохрома с и хромата калия по формуле (10).
6) Промойте колонку и все шланги дистиллированной водой.
7) Сделайте выводы из полученных результатов.
ОФОРМЛЕНИЕ ЗАДАЧИ
Задачу оформите в соответствии со следующим планом:
1) Название работы.
2) Краткое теоретическое введение (не надо дословно
переписывать методическое пособие; необходимо описать
принцип метода, который Вы используете в работе).
3) Цель работы.
Ход работы.
4.1. Описание заполнения колонки с указанием объема колонки и скорости тока элюирующего раствора;
4.2. Подробное описание всех этапов нанесения и разделения смеси веществ.