Иммунофлюоресценция, разработанная Кунсом в 1942 г., заключается в использовании для серологических реакций меченных флюорохромом сывороток. Меченная флюорохромом сыворотка образует с антигеном комплекс антиген — антитело, который становится доступным наблюдению под микроскопом в ультрафиолетовых лучах, возбуждающих свечение флюорохрома.
Более широко применяется метод непрямой иммунофлюоресценции, основанный на выявлении комплекса антиген — антитело с помощью люминесцирующей иммунной сыворотки против IgG-антител и используемый для обнаружения не только антигенов, но и титрования антител.
Изначально серодиагностика основывалась на выявлении антител. С появлением в середине 20 века реакций иммунофлюоресценции и пассивной гемагглютинации, обладающих большей чувствительностью, появилась возможность обнаруживать не только антитела, но и антиген непосредственно в материале от больных. Энзим-иммунологический и радиоиммунологический методы, по чувствительности на 2—3 порядка превышающие иммунофлюоресценцию и пассив-нуюгемагглютинацию, приближаются к методам биол. обнаружения бактерий и вирусов. Область их применения для обнаружения как антигенов, так и антител теоретически не ограничена.
Серодиагностика инфекционных болезней базируется на появлении антител к выделенному или предполагаемому возбудителю независимо от того, был ли обнаружен возбудитель в острой стадии болезни. Исследуют пары сывороток крови, взятых в начале болезни и 2—3 недели спустя. Прирост антител во второй сыворотке крови не менее чем в 4 раза по сравнению с первой является диагностически значимым. Имеет также значение, каким классом иммуноглобулинов представлены антитела. IgM-антитела обнаруживают в конце острого периода болезни и в ранней стадии реконвалесценции. IgG-антитела появляются в более поздние сроки реконвалесценции и циркулируют долго. Если у женщины в первом триместре беременности обнаруживают IgM-антитела к вирусу краснухи, то это служит основанием для прерывания беременности, т. к. в этот период плод особенно чувствителен к вирусу. При разных инфекционных болезнях избирательно используют наиболее специфические и удобные в исполнении методы.
Значительный прогресс науки в изучении тонкой антигенной структуры клеточных антигенов, антигенов бактерий и вирусов достигается благодаря применению в серологических реакциях моноклональных антител, которые можно получать к отдельным детерминантам антигена.
Глава 2. заголовок
Нормативные документы
1. ГОСТ 34105— 2017 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА. Серологический метод.
2. ГОСТ 33675-2015 Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологический метод.
3. Санитарные правила "Условия транспортировки и хранения медицинских иммунобиологических препаратов. СП 3.3.2.028-95"
Методы исследования
2.1. Отбор и транспортировка проб клинического материала
Забор проб клинического материала для исследования, их упаковку и транспортировку осуществляет медицинский персонал в соответствии с требованиями действующих санитарных правил по безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности), по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности и методических указаний по профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза людей.
Клиническим материалом для отбора проб, предназначенных для дальнейшего исследования на бруцеллез, от лиц с подозрением на бруцеллез, больных людей в зависимости от клинической формы болезни являются: кровь, костный мозг, спинномозговая жидкость, пунктат из лимфоузлов, моча, желчь, суставная жидкость (при артритах), гной (при абсцессах).
Материал от больных с подозрением на бруцеллез забирают при поступлении больного до начала антибиотикотерапии.
Отбор крови
При всех формах болезни берут кровь в объеме 10-15 мл с учетом необходимости проведения бактериологических, серологических исследований и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Непосредственно у постели больного 10 мл крови засевают в две емкости с бифазной средой для выделения гемокультуры, или по 5 мл вносят иглой через предварительно обработанную спиртом резиновую пробку во флаконы с питательной средой жидкой для транспортировки материала и накопления бруцелл (приложение 6), использование которой позволяет совместить этапы транспортировки материала в лабораторию и подращивания бруцелл.
Кровь у больного берут натощак из локтевой вены в количестве 5-10 мл, соблюдая правила асептики, шприцем или с использованием вакуумной системы типа "Vakuettе®" с активатором сыворотки. Шприцем кровь переносят в стерильную пробирку. Для получения сыворотки и предотвращения гемолиза пробирку с кровью оставляют при комнатной температуре в скошенном положении до образования сгустка.центрифугирование Полученную сыворотку отбирают в пластиковую пробирку, герметично закрывают и направляют в лабораторию для исследования на наличие специфических антител к возбудителю бруцеллеза.
Костный мозг получают путем пункции грудины шприцем с короткой и несколько затупленной иглой. Полученный костный мозг (в количестве нескольких капель) засевают в пробирку на питательные среды.
Спинномозговую жидкость отбирают после пункции поясничной,субокципитальной области или мозговых желудочков в количестве 0,1-0,3 мл и засевают на питательные среды (см. посевы крови).
Пробу мокроты, полученную в результате глубокого кашля, собирают в специальный стерильный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой.
При исследовании мочи собирают её среднюю порцию (10-20 мл) в специальный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой.
Пробы желчи (среднюю порцию) собирают при зондировании в процедурном кабинете. Над пламенем спиртовки открывают пробирку для сбора материала, полученную желчь (10-12 мл) помещают в одноразовую стерильную пробирку с завинчивающейся пробкой. При использовании стерильной стеклянной пробирки, закрытой газопроницаемой пробкой, после наполнения емкости обжигают горлышко и пробку в пламени спиртовки, закрывают пробирку. При использовании пробирки с газопроницаемой пробкой пробу доставляют в лабораторию в строго вертикальном положении, чтобы не замочить пробку желчью.
Бак посев
Отобранный клинический материал засевают на питательные среды по методу Кастанеда или на питательную среду для накопления бруцелл.
При обследовании больных, прошедших курс лечения антибиотиками, через 1 мес и спустя 4-6 мес после окончания курса антибиотикотерапии, а также больных хронической формой бруцеллеза в период обострения перед началом лечения, рекомендуется проводить посевы крови, пунктатов костного мозга и лимфатических узлов на специальную питательную среду для выделения L-форм бруцелл.
Материалом для исследования методом ПЦР являются: кровь, сыворотка крови, пунктат из лимфатических узлов, синовиальная жидкость. Забор, транспортировку и хранение биологического материала для проведения ПЦР осуществляют в соответствии с действующими методическими указаниями по организации работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности.