Понятие о культурах тканей.
кт – участки клеточного роста в спец пит среде ин витро. Можно получить из любого органа и ткани животного и человека, поэтому можно не исп дорогостоящ лаб и естественно восприимч животных. Исп органы молодых жив-х и эмбрионы, тк вирусы лучше размножаются в молодых и интенсивно раст орг.
Цели: выделение вирусв из патмат, поддерж вир в усл лаб, наработка вакцин, биомодель для пост РН и РГАд, титрование вирусов, изуч взаимод вируса с клеткой.
Требования: макс стерильность, пасуда нейтральная, поддерж и ростовые среды (в составе – ср Игла, 199, р Хенкса, гидролизат лактатальбумина; в ростовой – сыв крови; индикатор фенолрот: красный цве – пш среды нейтральна, жёлтая мутная – бакпророст, жёлтая прозрачная – гибель клеток, малинов – зещелач посуда)
Классификация: Переживающие, Растущие (плазменные, монослойные: первично-трипсинизир, субкультуры, диплоидные, перевиваемые)ю
Техника приготовления: Переживающие: готовят из орг и тк, кот измельч, отм от ФЭК ФБР, залив в спец пит среду, клетки во взвеш сост (Живые, но тер спос к пролиферации). Исп редко, против ящура)
Растущие:
1 Плазменные: орг и тк измельч, отм от ФЭК ФБР, во флакон внос плазму крови кур, пинцетом расп клетки в виде островков, для прикрепл – экстракт из кур эмбр (плазма сворачивается) или подогр дно до 45 град, залив рост среду, пом в термостат при т 37, через 2 суток – рост в виде пучков.
2 Монослойные: расп в 1 слой. В частности:
1.Первично трипсинизирванные: из люб орг и тк, 9-10 сут эмбриона, измельчают, отмыв от ФЭК ФБР, центрифугир (Ц), к осадку – 0, 25% трипсин, на магнитн мешалку на 30 мин при т 37. Трипсин расщипл кусочки тканей на отд клетки. Фильтруют через марлю, Ц в ФБР, р удаляют, осадок развод рост средой, доводя конц клеток до 40-80 тыс в 1 мл при пом кам Горяева. Клетки разлив по флаконам
2.Субкультуры получ из перв трипс. Удал рост среду, сним монослой при пом р-ра версена, отмыв от р-ра путём Ц, к осадку доб трипсин, далее см. перв трипсин.
3 Диплоидные: из перв трипс путём многократн пересевов на пит сред, клетки сохр жизнеспособн в теч 10 мес, потом – дегенерат измен и гибель
4.Перевиваемые: из опухол или дипл после обр УФЛ и ультразвуком, дипл приобр св-ва злокач опухолей.
Превично-трипсинизированные кт. Цпд вирусов.
Первично трипсинизирванные: из люб орг и тк, 9-10 сут эмбриона, измельчают, отмыв от ФЭК ФБР, центрифугир (Ц), к осадку – 0, 25% трипсин, на магнитн мешалку на 30 мин при т 37. Трипсин расщипл кусочки тканей на отд клетки. Фильтруют через марлю, Ц в ФБР, р удаляют, осадок развод рост средой, доводя конц клеток до 40-80 тыс в 1 мл при пом кам Горяева. Клетки разлив по флаконам.
ЦПД: после формирования монослоя удал рост среду, внос поддерж и доб вирус, помещ в термостат. Или с целью устран токсичности вируссод мат сначала могут внести вирус, ост на 1-2 часа, удалить вирус и внести поддерж среду. Флаконы – в термостат, кажд день – микроскопия под мал увел. через 2-3 суток в монослое обр пустоты, связ с ЦПД вируса. Флакон вынимают из термостата, удал поддерж среду, помещ в морозильн кам, где они сохр. При необходимости получ вируса флаконы 3 раза замор и размораж, доб ФБР и Ц, вирус – в надосад жидкости.
Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.
Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.
Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
Кулътивирование клеток может призойти в специальных флаконах (колбы-матрацы, флаконы Карреля) и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь какую-либо опору, например, стенку пробирки.
В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста микрофлоры вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками, чаще пенициллином и стрептомицином.
О наличии и размножения вируса в клетках узнают по так называемому цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки гибнут, и под микроскопом заметны дегенеративные изменения клеток. Пласты зараженных клеток отслаиваются от стенки пробирки или флакона. Так как рост клеток прекращается, pН среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса).
Питательной средой для культуры ткани могут быть различные растворы, сослав которых приближается к составу жидкости организма (синтетическая среда 199, солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактальбумина с сывороткой и другие).
28 Получение первично-трипсинизированных культур клеток из кожно-мышечной ткани развивающихся куриных эмбрионов. Куриные эмбрионы 9—11-дневной инкубации овоскопируют. Отбирают яйца с подвижными эмбрионами и хорошо выраженными сосудами. На скорлупе простым карандашом отмечают границы воздушной камеры и расположение зародыша.
Поверхность скорлупы протирают йодированным спиртом и обжигают. Стерильными ножницами срезают скорлупу на 2-3 мм выше границы воздушной камеры, разрывают подскорлупную и хорионаллантоисную оболочки и за шейку извлекают эмбрион, в стерильную чашку Петри у эмбриона удаляют голову, лапки, крылья и внутренние органы. Оставшийся кожно-мышечный мешок переносят в стерильную майонезную банку (250 мл) и измельчают ножницами на кусочки 3—4 мм.
Измельченную ткань 2—3 раза отмывают раствором Хенкса от слизи и кровяных элементов до получения прозрачных сливных вод и переносят в колбу для трипсинизации. В колбу наливают 0,15%-ный раствор трипсина, подогретого до 35-37 0С (соотношение ткани и трипсина 1:3), вносят стерильный магнитик и ставят на магнитную мешалку.
Трипсинизацию проводят дробно, т. е. через каждые 3—5 мин отделившиеся клетки вместе с трипсином сливают в центрифужные флаконы и помещают на лед или в холодильник для прекращения действия трипсина на клетки. К оставшемуся в колбе содержимому добавляют новую порцию трипсина. Скорость вращения на магнитной мешалке регулируют так, чтобы не было пены. Процесс повторяют несколько раз (3-5) до полного истощения ткани. После трипсинизации суспензию клеток в растворе трипсина центрифугируют при 1000 мин-1 10 мин, надосадочную жидкость сливают (выбрасывают), а осадок клеток ресуспендируют в теплой (37 °С) питательной среде (в заведомо известном объеме) и фильтруют через 3-слойный марлевый фильтр. После тщательного перемешивания клеток берут 1 мл для подсчета клеток.
Успех культивирования клеток в значительной степени зависит от посевной дозы. При малом количестве клеток не наблюдается образование монослоя даже при длительном культивировании. При слишком большой дозе клеток происходит интенсивная их пролиферация, и образованный слой клеток значительно раньше подвергается старению и неспецифической дегенерации.
29 (27,28) Субкультуры получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена (трипсина) и ресуспендирования в новой питательной среде. Через 2-3 суток вырастает новый монослой. Перевиваемые культуры клеток - клетки, снятые, перевитые, пассажированные из первичных клеток с повышенной активностью роста более 10 раз. Они способны размножаться вне организма неопределенно длительное время. Этапы получения субкультур. Успешное развитие современной вирусологии обусловлено в значительной мере применением различных культур тканей. Применение культур тканей в вирусологической практике дало возможность вести диагностические исследования без использования дорогостоящих лабораторных животных. Применяемые в практике культуры тканей обладают различной чувствительностью к одному и тому же вирусу, а поэтому важно подобрать наиболее чувствительную ткань. Культурой ткани называют кусочки ткани млекопитающих и возникающие из них участки клеточного роста, находящиеся в специальной питательной среде вне организма. Культурой клеток принято называть систему более или менее однородных клеток, полученных из ткани какого-либо органа и выращенных на стенке пробирки, флакона или матраца (ин витро, т. е. вне организма). Практически культуру тканей и культуру, клеток обычно называют просто «культура тканей». Культуру ткани можно получать практически из любого органа животных, человека или птиц, лучше для получения культур ткани брать ткань молодого организма и даже эмбриональную, т. к. клетки таких организмов более способны к размножению. Теоретическое обоснование метода тканевых культур дали А. Е. Голубев в 1874 г. и И. П. Скворцов в 1885 г. Основоположником получения тканевых культур и практического их применения является американский эмбриолог Росс Гранвиль Гаррисон(1907 г.). Левадити (1913 г.) выращивал в культуре ткани из ганглиев обезьяны вирус полиомиелита и бешенства, положив, таким образом, начало методу культивирования вирусов в выращиваемых ин витро тканях. В настоящее время накоплен большой опыт по выделению вирусов в культурах тканей и по технологии приготовления различных видов культур тканей. Все существующие и применяемые в вирусологической практике в настоящее время культуры тканей можно разделить на следующие виды: 1. Переживающие культуры тканей; 2. Растущие культуры тканей: а) плазменные; б) однослойные: первично-трипсинизированные, субкультуры, диплоидные и перевиваемые. Переживающие культуры тканей - это такие культуры тканей, у которых отсутствует пролиферация, т. е. рост и размножение клеток, но жизнеспособность клеток при этом сохраняется. Методика получения переживающих культур тканей впервые была разработана и предложена Мейтландами в 1928 году, которые использовали почки кур. Приготовление переживающих культур тканей в общих чертах заключается в измельчении тканей какого-либо органа на кусочки около 1 мм. Измельченные кусочки отмывают от форменных элементов крови и помещают в специальную питательную среду в стерильную посуду и инкубируют при 37°С. Фактически эти кусочки находятся во взвешенном состоянии в питательной среде, что достигается легким перемешиванием среды. Переживающие культуры тканей применяются для приготовления некоторых вакцин в промышленных условиях. Так, например, готовят противоящурную вакцину по методу Френкеля на переживающей культуре ткани из эпителия языка КРС. Для других целей эти культуры тканей практически мало пригодны и не применяются. Наиболее широко используют культуры растущих клеток, т. к. в таких культурах хорошо видны при просмотре под микроскопом клетки и цитопатогенное действие вируса на клетки культуры и можно видеть взаимодействие вируса с клеткой на уровне клетки. Культуры растущих клеток. Это такие культуры тканей, в которых клетки пролиферируют, т. е. делятся и размножаются. После заражения таких культур. вирусом в них хорошо видно действие вируса на клетки в виде специфической дегенерации пораженных клеток. К культурам растущих клеток относят плазменные культуры и однослойные культуры тканей. Плазменные культуры тканей (культуры фиксированных кусочков ткани). В основе приготовления плазменных культур положен метод Карреля-Барроуса (1910 г.). Метод по своей технике очень прост и заключается в тщательном измельчении какоголибо органа на кусочки величиной до 1 мм с последующим отмыванием измельченной ткани солевым сбалансированным раствором от форменных элементов крови. Затем в стерильную посуду (пробирки, флаконы, матрацы и др.) вносят несколько мл куриной плазмы крови и распределяют равномерным слоем по стенке или дну. В плазму на определенном расстоянии друг от друга помещают измельченные и отмытые кусочки ткани. Для свертывания плазмы вносят куриный эмбриональный экстракт. После свертывания плазмы кусочки прочно фиксируются на стенке посуды. В пробирки с фиксированными кусочками ткани вносят соответствующую питательную среду, закрывают резиновыми пробками и пробирки, или другую посуду, ставят в термостат для роста клеток при температуре 37°С. От кусочков начинают расти в сторону клетки, что видно под микроскопом при малом увеличении (вид паучков). Питательную среду заменяют в зависимости от скорости роста клеток. При заражении такой культуры вирусом можно будет видеть действие вируса на клетки. Фиксировать кусочки ткани можно помимо плазмы предварительным нагреванием стенки пробирки до 45°С и кусочки ткани прикрепляются к предварительно нагретой стенке, а затем вносят питательную среду и ставят в термостат. Однослойные (монослойные) культуры тканей. Это такие культуры, в которых клетки пролиферируют, т. е. растут и размножаются и образуют в результате этого на стенках пробирки или матраца сплошной клеточный пласт в один слой клеток. Методика получения однослойных клеточных культур тканей впервые была разработана в 1952 г. Дулбекко и в 1954 г. Дулбекко и Фогтом, которые использовали для этих целей ткани куриного эмбриона и почки обезьяны. В основе метода лежит обработка измельченных и отмытых от форменных элементов крови кусочков тканей протеолитическими ферментами (трипсин, панкреатин, коллагеназа и др.) с целью получения взвеси отдельных клеток. Разъединение клеток происходит за счет разрушения ферментами межклеточных протоплазматических мостиков. Наиболее широкое применение в вирусологической практике в настоящее время получила методика однослойных культур трипсинизированных клеток, т. е. методика с применением трипсина. Для приготовления однослойных культур можно применять различные органы и ткани животных, птиц и человека. Однослойные культуры являются основными в вирусологии и представляют наиболее удобную биологическую модель для выделения вирусов, изучения процессов взаимодействия вирусов и клеток, они широко применяются в практической и научно-исследовательской работе для титрации вирусов, для накопления вирусов и получения антигенов, вакцин, для постановки реакций нейтрализации вируса и задержки гемадсорбции т. д. Для получения культур ткани очень важно правильно подобрать и подготовить посуду, пробки, питательные (ростовые) и поддерживающие среды, солевые растворы. Посуду желательно применять из нейтрального стекла, она должна быть идеально чистая и хорошо вымыта. Существует много способов мытья, но все они сводятся к получению идеально чистой посуды с нейтральной рН. Чаще для этих целей применяют мытье с детским мылом и гексаметафосфатом. Хранить посуду для приготовления культур тканей нужно отдельно от другой посуды и применять ее только для работы с культурами тканей. Пробки применяют резиновые, которые также должны быть хорошо вымыты и стерильные. Инструменты, применяемые для приготовления культур тканей, после стерилизации кипячением хранят в спирте (ножницы, пинцеты, скальпели и др.). Все солевые буферные растворы, а также питательные и поддер- >юивающие среды готовят только на би- и тридистиллированной воде. Для отмывания тканей от кровяных элементов, приготовления разведения трипсина используют фосфатные буферные растворы различного состава и раствор Хенкса, включающий в состав 8 солей и глюкозу. В качестве питательной среды для клеток чаще применяют раствор следующего состава: 80 частей рабочего раствора Хенкса +10 частей 5%-ного раствора гидролизата лактальбумина +10 частей сыворотки крови КРС. Используются и более сложные питательные среды - среда 199, среда Игла, среда Эрла и др. В среду Игла входит более 60 компонентов. Для контроля за изменением рН питательной и поддерживающих сред в процессе роста клеток в них вносят индикатор феноловый красный (фенолрот). Вся работа по приготовлению культур тканей и в процессе заражения ее вирусом проводится только в стерильных условиях бокса. Однослойные культуры тканей делятся на следующие виды: 1. Первично-трипсинизированные культуры. Методику приготовления первично-трипсинизированных культур разработали Дулбекко и Фогт. Принцип приготовления таких культур ткани по методу Дулбекко и Фогт в модификации Янгнера заключается в следующем: стерильно извлекают почки обезьяны (можно также готовить культуру из любых органов животных, птиц и человека) и снимают капсулу, срезают корковый слой и измельчают его ножницами в баночке на мелкие кусочки. Измельченную ткань отмывают фосфатно-буферным раствором от форменных элементов крови до полного просветления надосадочной жидкости, затем на одну часть измельченной ткани вносят 3 части 0,25%-ного раствора трипсина, подогретого до 37°С, и инкубируют в термостате 30-40 минут, после чего трипсин сливают. К ткани затем добавляют новую порцию подогретого трипсина, переносят в колбочку с магнитиком и ставят колбочку на магнитную мешалку для лучшего разделения клеток (диспергирования). Полученную таким образом взвесь клеток в растворе трипсина сливают через марлевый стерильный фильтр для освобождения от неразбившихся крупных частиц ткани во флакон и центрифугируют для осаждения клеток 5-10 минут при 1000-1500 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок клеток ресуспензируют в питательной среде для клеток. Полученную взвесь клеток подсчитывают с. помощью камеры Го- ряева из расчета на один мл, доводят концентрацию клеток до нужной посевной дозы (в зависимости от вида ткани и возраста животного от 200 тысяч до 800 тысяч клеток в 1 мл) добавлением питательной среды и разливают по стерильным пробиркам или матрацам, которые затем ставят в термостат при температуре 37-38°С. Пробирки ставят в штативе наклонно под углом в 7-10°. В течение первых часов инкубации в термостате клетки оседают и прикрепляются к стенке пробирки или матраца, а позже начинают расти и размножаться, образуя через некоторое время (1-5 дней) на стенке сплошной клеточный монослой. Клетки хорошо видны под малым увеличением микроскопа, а после заражения их вирусом можно видеть изменения в клетках за счет патогенного действия вируса. По данным Янгнера и Л.Т. Степановой только 10% внесенных клеток прикрепляется, дают рост и принимают участие в образовании монослоя. После сформирования монослоя культуру ткани используют для заражения вируссодержащим материалом. Наиболее широко из первично-трипсинизированных культур тканей применяют культуру куриных фибробластов. Для получения культуры куриных фибробластов берут куриный эмбрион в возрасте 10-12 дней, дважды обрабатывают скорлупу спиртом и обжигают. Затем в стерильных условиях извлекают со строжайшим соблюдением асептики эмбрион в стерильную чашку Петри, где с помощью пинцетов удаляют глаза и кишечник. Кожно-мышечную ткань переносят в стерильную баночку и здесь ножницами измельчают нр. мелкие кусочки до кашицеобразной массы, промывают 3-5 раз раствором Хенкса или другим фосфатно-буферным раствором для отмывания ткани от крови. Затем к отмытой ткани наливают 0,25%-ный раствор лодогре- того до 37°С трипсина из расчета на 1 г ткани 10-40 мл трипсина и ставят на 20-30 мин в термостат. После этого трипсин сливают, вносят фосфатно-буферный раствор, переливают в колбочку с магнитиком и ставят на магнитную мешалку. Перемешивают содержимое колбы на мешалке до тех пор пока кусочки ткани разобьются на отдельные клетки и жидкость станет мутной. Взвесь клеток затем через марлевый фильтр сливают во флакон. Если кусочки не разбились полностью и еще остались, наливают новую порцию буфера и опять диспергируют на магнитной мешалке, иногда так повторяют 3-4 раза. Взвесь клеток во флаконе центрифугируют при 1,0-1,5 тысячах оборотов в минуту 5-10 минут и клетки оседают. Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку наливают 5-10 или более миллилитров питательной среды и при помощи пипетки клетки ресуспензируют в питательной среде. Количество клеток в мл взвеси подсчитывают в камере Горяева, доводят до концентрации 250-400 тысяч клеток в 1 мл и разливают по пробиркам. Пробирки закрывают резиновыми пробками и ставят в термостат на подставку наклонно под углом 7- 10°. Через 2-3 дня на нижней стенке пробирки вырастает клеточный монослой. 2. Субкультура (вторичная культура клеток). Получается из пер- вичнотрипсинизированной культуры тканей. Для этого выросший клеточный монослой снимают со стенки пробирки или матраца путем соскабливания или воздействия раствором версена, затем подвергают трипсинизации для разделения клеток, центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, осадок клеточный ресуспензируют, разливают и вновь выращивают в другой посуде и в новой порции питательной среды. В этом случае вырастает вторичная культура (субкультура). 3. Диплоидная культура клеток (полуперевиваемая культура). Получают их из клеток какого-либо органа животных или человека путем многократных перевиваний. Клетки таких культур не носят злокачественного характера, имеют свойства нормальных клеток и обладают диплоидным набором хромосом. Это морфологически однородная популяция клеток с ограниченным сроком жизни, способные многократно перевиваться. Клетки таких культур ткани могут пассажироватьея в условиях лаборатории до 10 месяцев, но затем погибают, т. е. подвергаются дегенерации и отмирают. 4. Перевиваемые культуры клеток. Это постоянно растущие клетки, не имеющие предела роста и размножения, они, как правило, носят злокачественный характер. Получают перевиваемые клетки из различных злокачественных опухолей, удается получать и из нормальных тканей путем длительных перевиваний, но в последующем выделенные клетки приобретают злокачественные свойства. Сейчас есть много видов перевиваемых клеток (клетки Хеля, Hep-1, Нер-2, Дейтроид-6 и др.). Перевиваемые клетки можно в условиях лаборатории сохранить и перевивать годами. Для заражения вируссодержащим материалом выбирают такие пробирки или матрацы с культурой тканей, в которых сформировался сплошной клеточный монослой. Наиболее широко используют в диагностических целях первичнотрипсинизированные культуры. Перед заражением ростовая (питательная) среда сливается, в пробирку с культурой ткани вносят 0,1 мл вируссодержащей жидкости и 0,9 мл поддерживающей среды, которая обычно бывает аналогична по составу ростовой среде, но без добавления сыворотки, т. к. сыворотка стимулирует рост и размножение клеток, а в данном случае нужно только поддерживать жизнеспособность клеток без пролиферации их. После этого пробирки помещают в термостат в обычном для них положении под углом в 7-10° для дальнейшего культивирования. Поддерживающая среда обеспечивает переживание клеток, но не стимулирует их рост. Иногда заражение проводят контактным способом, т. е. после внесения вируссодержащего материала контактируют его с клетками 1-2 часа, а затем сливают материал, наливают новую порцию поддерживающей среды и ставят в термостат. Этим способом пользуются при заражении культуры ткани патологическим материалом с целью устранения токсичности материала на клетки культуры. После внесения вируссодержащего материала в пробирку с культурой ткани вирус проникает в чувствительные клетки и начинает в них размножаться. Нужно помнить, что не все культуры клеток являются чувствительными ко всем вирусам. В одних культурах ткани размножаются одни вирусы, в других иные, а некоторые вирусы вообще не размножаются. Поэтому надо подбирать вид культуры ткани для конкретного возбудителя. За зараженными культурами ежедневно наблюдают просмотром под микроскопом и отмечают характер дегенеративных изменений в клетках. Под действием вируса пораженные клетки уже через 24 часа или позже начинают деформироваться, подвергаются деструкции, может появиться зернистость, округление клеток, вакуоли, в некоторых случаях происходит слияние клеток с образованием большой многоядерной клетки или образуются симпласты и синцитии. Пораженные клетки могут группироваться в гроздья и затем разрушаются, отпадают от стенки и появляются пустоты в монослое клеток. Все эти изменения хорошо видны под микроскопом. Некоторые вирусы (чума свиней и др.) могут размножаться в клетках, не вызывая дегенерации и деформации их. Деформация и дегенерация клеток культуры ткани под воздействием различных вирусов может быть различной, но, как правило, всегда носят специфический характер. Способность вируса вызывать определенные морфологические и дегенеративные изменения клеток в зараженных культурах тканей принято называть цитопатогенным действием вируса (ЦПД). Когда в зараженных культурах тканей ЦПД вируса будет хорошо и четко выражено и более половины пласта клеток (50%) будет дегенерировано, такие культуры удаляют из термостата и хранят до дальнейшего их использования в замороженном состоянии в холодильнике при -20°С (в морозилке бытового или в специальном низкотемпературном холодильнике). Пробирки с четко выраженным ЦПД для дальнейшей работы, если нужно снять клетки со стенки пробирки и для освобождения вируса из зараженных клеток в жидкость, подвергают двух-трех - кратному замораживанию и оттаиванию.