Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.
Методика р-ии. В пробирки с зараженным вирусом культурой ткани вносят 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубации и вида вируса. Учет реакции производят под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них послее 1-2 кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образуют характерные скопления.
Гемадсорбция - процесс адсорбции эритроцитов на поверхности инфицированных вирусами клеток. Наблюдается в основном у вирусов, вирионы к-рых после образования выходят из клетки путем почкования, напр., у орто- и парамиксовирусов. Проводят для индикации вируса на чувствительной к нему к-ре клеток. Наблюдаются различия в типе адсорбции (диффузный, очаговый), виде сорбируемых эритроцитов (человека, обезьян, морской свинки и др.), температуре, при к-рой протекает реакция (37°С, 0°С), наличии элюции (есть, нет). Г. может быть заторможена предварительной инкубацией инфицированной вирусом к-ры клеток со специфической к вирусу антисывороткой. Реакцию торможения Г. используют для идентификации вирусов.
37 Реакция торможения гемадсорбции (РТГАд) Эту реакцию используют в том случае, если вирус обладает гемадсорбирующими свойствами. Гемадсорбцией называется адсорбция (прилипание) эритроцитов к поверхности клеток, зараженных вирусом. Чаще это явление наблюдают у гемагглютинирующих вирусов. Так, гемадсорбирующими свойствами обладают вирусы гриппа, вирус ПГ-3 и некоторые штаммы парвовирусов крупного рогатого скота и др.
Чтобы наблюдать гемадсорбцию, из пробирки с зараженной вирусом культурой клеток удаляют культуральную жидкость и вносят 0,5%-ную взвесь эритроцитов (для вируса ПГ-3 — эритроциты морской свинки, для вирусов гриппа — эритроциты кур), оставляют на 5—10 мин, затем слой клеток споласкивают физиологическим раствором (чтобы смыть эритроциты). Если в зараженной культуре клеток идет репродукция вируса, то на таких клетках под малым увеличением микроскопа можно видеть адсорбировавшие эритроциты, в контрольных (незараженных) культурах клеток таковые отсутствуют.
РТГАд основана на торможении гемадсорбции, если зараженную вирусом культуру клеток предварительно обработать специфической сывороткой (содержащей антитела к этому вирусу). Так, для идентификации вируса ПГ-3 крупного рогатого скота широко используется данная реакция.
Методика постановки РТГАд заключается в следующем: на 3—7-й день после заражения культур клеток из них удаляют питательную среду, промывают клетки раствором Хенкса и вносят в каждые 4 пробирки по 0,5 мл специфической к вирусу ПГ-3 сыворотки в разведении 1:10;
пробирки в наклонном положении оставляют при комнатной температуре на 30 мин (для контакта клеток с антителами);
во все пробирки вносят по 1 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов морской свинки;
через 30 мин — учет результатов. Отсутствие гемадсорбции в пробирках со специфической сывороткой и проявление ее в пробирках с зараженной культурой клеток, но не обработанной специфической сывороткой, свидетельствует о наличии вируса ПГ-3 в культуре клеток.
Чаще всего РТГАд применяют для идентификации вируса и редко для обнаружения и титрования антител.
38 Микроскопический метод исследования патматериала при вирусных болезнях. При многих вирусных заболеваниях в цитоплазме или ядре пораженных вирусом клеток формируются тельцавключения, которые по форме и величине могут значительно варьировать. В одной клетке может быть от одного до 5-6 телец. Размеры телец-включений зависят от вида вирусов и стадии течения болезни (в самом начале болезни их немного, и они мелкие, а затем укрупняются и могут достигать значительных размеров). При коротком инкубационном периоде телец- включений может и не быть. Обнаружение телец-включений с помощью светового микроскопа в ряде случаев (при бешенстве и др.) служит основанием для постановки диагноза. Такие тельца хорошо изучены при оспе, бешенстве, чуме и гепатите плотоядных, ларинготрахеите и др. В световом микроскопе при специальных методах окраски (серебрение по Морозову и др.) удается иногда видеть более крупные вирусные частицы, как например, элементарные тельца возбудителя группы оспы. Для микроскопии в обычном микроскопе из патологического материала готовят мазки или мазкиотпечатки, либо делают гистосрезы из органов. Иногда используют инфицированные вирусом клетки культур тканей, выращенные на покровных стеклах. Наиболее удобны мазки-отпечатки, т. к. в этих случаях хорошо будет видно расположение телец-включений в клетке. Мазки и мазки-отпечатки фиксируют на пламени или химическим методом в метиловом спирте, смеси спирта этилового с эфиром поровну, химически чистым ацетоном. При бешенстве мазки фиксируют химическим методом 1-2 часа, а ацетоном не менее 10 часов в морозилке холодильника. Мазки-отпечатки и гистологические срезы при бешенстве делают из головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, продолговатый мозг) и из слюнных желез. Гистосрезы фиксируют по специальной методике в спирте и затем красят. Фиксированные мазки и отпечатки для выявления телецвключений окрашивают по соответствующим методикам и просматривают затем под микроскопом с увеличением объектива 40х или 90х. Для окраски мазков предложено много методов и их модификаций. При бешенстве для окраски мазков и отпечатков чаще всего пользуются методом Муромцева или Михина. Тельца Бабеша-Негри находят в цитоплазме нервных клеток. Окраска по Муромцеву, Мазки фиксируют в метиловом спирте или спирт + эфир 1-2 часа, или ацетоном 10-12 часов. Затем поомыва- ют дистиллированной водой и на 5-10 минут погружают в раствор синьки Мансона (2,0 синьки и 5,0 буры растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды), разведенной водой 1:40. После этого краску сливают и тут же мазки, не промывая водой, погружают в 10% водный раствор таннина на 8-10 минут до появления голубоватой окраски. Затем промывают водой, высушивают фильтрованной бумагой, проводят через смесь из равных частей спирта с ацетоном или спирта с ксилолом и снова высушивают фильтровальной бумагой. Заливают в канадский бальзам. Окрашенный мазок должен иметь светло-голубой фон. Ядра нервных клеток окрашиваются в синий цвет, цитоплазма клеток бледно-голубая, а тельца Бабеша-Негри - в бледно-фиолетовый с розоватым оттенком и с темными включениями. Окраска по Михину. Фиксированные химическим способом мазки окрашивают (после высушивания) 30-40 минут краской Гимза, раз- неденной 1:10 (1-2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды). Натем быстро промывают подкисленным спиртом (1 капля ле/1Яной уксусной кислоты на 30 мл 96° спирта), а затем водой, просушивают фильтрованной бумагой и исследуют. Фон мазка должен быть красным с фиолетовым оттенком, нервные клетки синеватые, ядро клеток черные, а тельца Бабеша-Негри розово-красные с точечными включениями темно-синего цвета. Есть способы окраски по Селлерсу, Борману, Манну и др.
39 Иммуноферментный анализ (ИФА) В диагностике вирусных болезней человека и животных широко применяют методы, основанные на использовании ферментов в качестве метки антигенов и антител. Это группа методов носит название иммуноферментного анализа.ИФА применяют в двух вариантах: гистохимическом и твердофазном.Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазную реакцию, используют редко. Он аналогичен методу иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом.Для метки антител обычно применяют ферменты: пероксидазу хрена (чаще), щелочную фосфатазу, галактозидазу и др.Таким образом, в комплекс антиген + антитело включаются антитела, меченные ферментом, и для обнаружения этого комплекса вносят субстрат (фермент-чувствительное вещество), которое под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментативной реакции, хорошо видимый в световом микроскопе.В качестве субстрата используют ортофенилендиамин, 5-аминосалициловую кислоту или бензидин. К ним добавляют пероксид водорода (Н2O2).Материалом для выявления вирусных антигенов при этом варианте могут быть: мазки; отпечатки различных органов; парафиновые срезы; культуры клеток. При этом можно использовать как прямой, так и непрямой метод. Прямой метод. На фиксированный препарат наносят конъюгат (антитела к предполагаемому вирусу, меченные ферментом), выдерживают при 37 °С в течение 1—2 ч во влажной камере, затем препарат отмывают физиологическим раствором от несвязанного конъюгата, подсушивают на воздухе, наносят несколько капель раствора субстрата, инкубируют 5— 10 мин и промывают физиологическим раствором. Затем споласкивают дистиллированной водой, и результат учитывают с помощью светового микроскопа. В положительных случаях, т. е. при наличии антигена в исследуемом материале, видны или диффузное желто-коричневое окрашивание, или гранулы коричнево-черного цвета. В контрольных препаратах окрашивания не обнаруживают. Непрямой метод. На фиксированный препарат наносят специфическую к предполагаемому вирусу сыворотку, выдерживают при 37 °С в течение 1—2 ч во влажной камере, промывают физиологическим раствором, подсушивают на воздухе и наносят меченную ферментом антивидовую сыворотку, выдерживают при 37 °С 1—6 ч. Далее следует процедура, как в прямом методе.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФИФА, РЭМА — реакция энзиммеченых антител, ELISA — enzyme-linked immunosorbent assay) в последние годы широко используют в биологии, в том числе и в вирусологии. Характерная особенность метода в том, что один из компонентов реакции (антиген или антитело) фиксируют на твердом носителе. В качестве носителей используют полистироловые микропанели, шарики, палочки и др.Этим методом можно обнаружить и идентифицировать антиген, а также выявить антитела и определить их титр в сыворотках крови.Существует много вариантов метода. Наиболее часто для обнаружения антигенов используют прямой метод («сандвич»-метод). Для этого специфические к предполагаемому антигену антитела фиксируют в лунках микропанелей, в которые вносят исследуемый антиген и выдерживают при 37 °С 1—2 ч. Затем микропанели промывают буферным раствором и вносят в лунки меченные ферментом к предполагаемому антигену антитела, выдерживают при 37 °С 1—2 ч, промывают микропанели, вносят раствор субстрата и выдерживают 5—30 мин. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты и учитывают визуально по разности в окраске опытных и контрольных образцов или при помощи спектрофотометрии. Положительные образцы имеют окраску от желтой до оранжево-коричневой.Обнаружение и определение титра антител проводят непрямым твердофазным методом.В крупных диагностических лабораториях применяют полностью автоматизированные установки для проведения твердофазного ИФА, позволяющие анализировать от 1000 до 4000 проб ежедневно.Достоинства ИФА: высокая чувствительность; специфичность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов; не требуется специальных приборов; оценку можно проводить визуально; возможность автоматизации, что позволяет его применять для массовых исследований; исследуемые сыворотки не требуют предварительной обработки. Это — экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ.
40 Люминесцентная микроскопия в вирусологии. Метод флюорохромирования (МФ) и методы флюоресцирующих антител. Среди новейших способов диагностики бактериальных и вирусных заболеваний особое место занимает люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия. Повышенная чувствительность, цветное изображение на темном нефлуоресцирующем фоне, возможность обнаружения телец-включений, некоторых крупных вирусов и риккетсий, простота и надежность - ценные качества этого вида микроскопии. Особое значение люминесцентная микроскопия имеет при ускоренной диагностике инфекционных заболеваний, при ускоренной индикации возбудителя во внешней среде. Результаты люминесцентной микроскопии являются довольно специфичными и высокоточными. По данным ряда авторов этот метод не уступает по показаниям данным биопробы и другим методам, однако для люминесцентной микроскопии нужно иметь высококачественные специфические флуоресцирующие сыворотки или иммуноглобулины. Люминесцентная микроскопия в последние годы находит все большее применение и является одним из главных методов при диагностике многих вирусных болезней. В люминесцентной микроскопии используется явление фотолюминесценции, т. е. способность объекта светиться (издавать свечение) в момент облучения его ультрафиолетовыми лучами. Источниками таких лучей в люминесцентном микроскопе являются ргутно-кварцевые лампы. Для проведения микроскопии в настоящее время выпускаются люминесцентные микроскопы серии ЛЮМАМ, а также люминесцентные устройства, которые монтируются на обычный световой микроскоп, такие как ОИ-28 и другие. Результаты, получаемые при работе с люминесцентными устройствами, лишь незначительно уступают результатам, получаемым при работе со специальными люминесцентными микроскопами. Как микроскопы люминесцентные, так и устройства должны быть хорошо настроены, комнату для работы затемняют. Для иммерсионной микроскопии при люминесцентном исследовании используют специальное нефлуоресцирующее масло, заменители его (диметилфтолат ДЭТА) или просто дистиллированную воду при водной иммерсии. Настройку микроскопа или устройства проводят согласно прилагаемой к ним инструкции. Объекты, рассматриваемые при люминесцентной микроскопии, могут давать собственную люминесценцию (аутолюминесценция), как, например, грибки микроспории, и такие объекты смотрят без всякой дополнительной окраски. Однако большинство патогенных микроорганизмов и вирусы аутолюминесценцией не обладают, а поэтому мазки надо обрабатывать либо специальными красками (флуорохромы), либо мечеными (флуоресцирующими) антителами. В связи с этим все методы обработки мазков для люминесцентной микроскопии можно разделить на две группы: 1. Метод флуорохромирования (МФ). 2. Методы флуоресцирующих антител (МФА) или иммунофлуо- ресценция (ИФ). а) Метод флуорохромирования. По своей технике этот метод принципиально почти ничем не отличается от методов обычной окраски мазков, применяемых при световой обычной микроскопии. Для этих целей используют также анилиновые красители, но краски берут такие, которые обладают явлением фотолюминесценции, т.е. светятся в момент облучения их ультрафиолетовыми лучами. Такие краски называются флуорохромами, а окраска ими - метод флуорохромирования. К флуорохромам относят такие красители как акридин оранжевый и желтый, аурамин, корифосфин, родамин, трипафлавин, риванол, флуо- ресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) и другие. Продается специальный набор - «Набор красителей для флуоресцентной микроскопии», содержащий 20 красителей. Растворяют флуорохромы в дистиллированной воде (или буфере), к некоторым из них добавляют фенол до 5%. Разведения для большинства красителей обычно готовят 1:1000 (акридин желтый 1:500, акридин оранжевый, родамин и корифосфин 1:10.000). Наибольший интерес здесь представляет акридин оранжевый, который окрашивает ДНК в ярко светящийся желто-зеленый цвет, а РНК в оранжево-красный. Для исследований можно готовить мазки из патматериала, мазки-отпечатки, гистосрезы, зараженные культуры ткани, выращенные на покровных стеклах. Чтобы различить происхождение ДНК или РНК (клеточное или вирусное) препараты (мазки, мазки-отпечатки) обрабатывают 0,5%-ным раствором ДНКазы или PIIK-азы в течение 5-10 минут. При этом свечение клеточных ДНК или РНК сразу же исчезает, а вирусные ДНК или РНК продолжают светиться еще 20-30 минут. Это служит доказательством специфичности вирусных нуклеиновых кислот. Метод флуорохромирования широко применяется при диагностики бактериальных болезней и для этого имеются разработанные ВИЭВ рекомендации для окрашивания различных микробов и спор.
Методы флюоресцирующих антител (МФА). Сущность и разновидности МФА. Методы флуоресцирующих антител (МФА), иммунофлуо- ресценция (ИФ). МФА (ИФ) основаны на принципе специфического взаимодействия антигена со специфическими антителами, но используют здесь антитела меченые, т.е. предварительно окрашенные флуорохромом, и поэтому такие антитела под ультрафиолетовыми лучами светятся (флуоресцирующие антитела). Наиболее часто для окрашивания антител применяют ФИТЦ, эта краска дает антителам салатнозеленое свечение. Поэтому, если в мазке есть антиген специфический данным антителам, то антитела, оседая и связываясь с данным антигеном, будут обеспечивать образовавшемуся комплексу свечение салатно-зеленым цветом. Следовательно, здесь свечение антигена происходит не за счет окрашивания его, а за счет связавшихся с антигеном специфических окрашенных антител. Таким образом, все МФА являются по своей сущности разновидностью серологических реакций, но ставятся они не в пробирках, а на предметном стекле (в мазках) и используются флуоресцирующие антитела. В настоящее время налажено производство флуоресцирующих иммунных сывороток и гамма-глобулинов централизованным путем. Выпускаются они в сухом виде в ампулах с приложением на каждую упаковку инструкции по применению с указанием титра антител. Растворяют их для использования по мере надобности согласно инструкции, хранят в холодильниках при +4° С. Некоторые флуоресцирующие сыворотки выпускают в жидком виде. МФА находят широкое применение при диагностике многих вирусных болезней - бешенство, грипп, болезнь Аусеки, вирусный гепатит плотоядных и чума, оспа, ИРТ, ИЛТ и многие др. Все методы флуоресцирующих антител можно разделить на 2 разновидности: 1. Прямой МФА (предложен Кунсом и Капланом, 1942, 1950 гг.). 2. Непрямые МФА: а) с использованием антивидовой флуоресцирующей сыворотки или иммуноглобулина (метод Уэллера и Кунса, 1954 г.); б) с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сыворотки или иммуноглобулина (метод Гольдвассера-Шепарда, 1858 г.).
41 Прямой метод флюоресцирующих антител (МФА), его сущность и техника постановки. Этот метод технически наиболее прост и более специфичен по результативности и поэтому более широко применяется в практической работе. Сущность и техника прямого МФА заключатся в том, что на предметное стекло с фиксированным на нем м^шГ(или мазком-отпечатком) из вируссодержащего материала наносят небольшое количество (2-3 капли) специфической подозреваемому антигену (вирусу) флуоресцирующей иммунной сыворотки, или иммуноглобулина, в рабочем титре и выдерживают во влажной камере (в чашке Петри с кусочком ваты, смоченной водой) в термостате в течение 30-40 минут при 36-37° С, а затем промывают буферным солевым раствором и дистиллированной водой, высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионной системой в люминесцентном микроскопе. Если антиген и антитела специфичны, образуется комплекс «антиген + антитело», который не смывается при промывании мазка и при микроскопии препарата будет отчетливо видно яркое салатно-зеленое свечение антигена за счет адсорбированных на нем флуоресцирующих антител. Если же антитела были неспецифичны антигену, находящемуся в мазке, или антигена в мазке вообще не оыло (от здоровых животных), то свечения антигена не будет и поле зрения будет темным потому, что антитела не связались с фиксированным мазком и смылись при промывании мазка. Предметные стекла для МФА должны быть тонкие, чистые и хорошо обезжиренные. Мазки и мазки-отпечатки нужно готовить тонкие, высушивают мазки на воздухе и фиксируют химическим способом (ацетон, метиловый спирт, спирт + эфир), можно фиксировать пламенем. В мазках-отпечатках при вирусных инфекциях наблюдают свечение при просмотре в ядрах или цитоплазме пораженных вирусом клетках в виде различных гранул и телец-включений, а если клетка поражена вся и антиген содержится как в ядре, так и в цитоплазме, может светиться вся клетка. Непораженные вирусом клетки обычно не светятся и создают темный фон. К недостаткам прямого метода следует отнести то, что при этом методе в лаборатории на каждое вирусное заболевание нужно иметь специфическую флуоресцирующую сыворотку или глобулины, а они пока еще сравнительно дорогие и имеют небольшой срок хранения.
42 Непрямые методы флюоресцирующих антител (МФА). Их сущность и техника постановки. называются так потому, что флуоресцирующие антитела адсорбируются не на сам вирусный антиген, а на посредника, в качестве которого может быть специфическое вирусному антигену неокрашенное антитело (при антивидовом методе) или комплемент (при антикомплементарном методе). Непрямые МФА связаны с обработкой мазка в два этапа: вначале наносят специфическую вирусному антигену нефлуоресцирующую сыворотку (при антикомплементарном методе и комплементе одновременно) и контактируют 30-40 минут во влажной камере при 37° С, затем промывают буфером и водой (или просто водой) и наносят флуоресцирующую сыворотку специфичную противовирусным неокрашенным антителам (при антивидовом методе) или комплементу (при антикомплементарном методе), опять контактируют 30-40 минут во влажной камере в условиях термостата, промывают, высушивают на воздухе и смотрят под люминесцентным микроскопом. Непрямой МФА с использованием антииилоной флуоресцирующей сыворотки» На фиксированный мазок или отпечаток наносят специфическую предполагаемому в мазке антигену (вирусу) иммунную неокрашенную сыворотку или иммуноглобулин, и выдерживают во влажной камере или термостате при 37°С 30-40 минут, затем промывают буферным раствором и водой. Если в мазке имеется антиген специфичный антителам сыворотки, образуется комплекс «антиген + антитело» (Аг + Ат), который не смывается при промывании мазка, но и не светится в люминесцентном микроскопе. Поэтому мазок дополнительно обрабатывают флуоресцирующей антивидовой сывороткой или глобулином (антивидовую сыворотку или глобулин получают путем гипериммунизации кроликов или другие виды животных сывороткой или глобулинами того вида животных, на которых получают специфическую для вируса гипериммунную нефлуоресцирующую сыворотку и такую антивидовую сыворотку обрабатывают флуорохромом, обычно ФИТЦ). Антивидовую флуоресцирующую сыворотку наносят на мазок и выдерживают во влажной камере при 37° С 30-40 минут, затем промывают водой или буфером и водой, высушивают на воздухе и смотрят. Антитела из флуоресцирующей антивидовой сыворотки, если они специфичны глобулинам неокрашенной иммунной противовирусной сыворотки, адсорбируются на комплексе Аг + Ат и образуется новый комплекс «Аг (вируса) + Ат противовирусной неокрашенной сыворотки (они же являются Аг для антивидовой сыворотки) + Ат (флуоресцирующие) антивидовой сыворотки». При просмотре под люминесцентным микроскопом образовавшийся комплекс будет светиться ярко салатнозеленым цветом за счет флуоресцирующих антител антивидовой сыворотки. Если же в первом этапе обработки компоненты были неспецифичны или не было в мазке антигена, комплекс «Аг + Ат» не образуется и антивидовые флуоресцирующие антитела не свяжутся, при промывании мазка смоются с него и поэтому свечения не будет. Непрямой МФА с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сыворотки. Этот метод по своей сущности и технике является разновидностью РСК, но ставится реакция на предметном стекле и вместо гемолитической системы используют флуоресцирующую антикомплементарную сыворотку. Получают антикомплементарную сыворотку путем гипериммунизации кроликов натив- ной свежей сывороткой морской свинки (комплемент) и у кролика образуются антикомплементарные антитела, которые будут специфичны белкам сыворотки крови морской свинки (комплементу) и в реакцию будут вступать только с сывороткой крови морской свинки, которая является комплементом в РСК. Такую антикомплементарную сыворотку обрабатывают флуорохромом ФИТЦ-ем и получается флуоресцирующая сыворотка. На приготовленный и фиксированный мазок вначале наносят специфическую предполагаемому в мазке антигену (вирусу) нефлуорес- цирующую иммунную сыворотку и комплемент в рабочих титрах, контактируют в термостате при 37° С во влажной камере 30-40 минут (проходит реакция в баксистеме), а затем промывают водой. В случае, если, как и в пробирочной РСК, антиген в мазке будет специфичен нанесенным антителам, образуется комплекс «Аг вируса + Ат», на который адсорбируется комплемент и весь этот комплекс «Аг вируса + Ат иммунной неокрашенной сыворотки + комплемент» не смоется, но свечения под люминесцентным микроскопом не будет. Чтобы обнаружить этот комплекс, на мазок дополнительно затем наносят антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку и вновь контактируют во влажной камере термостата 30-40 минут, после чего промывают, высушивают на воздухе и смотрят под люминесцентным микроскопом. Флуоресцирующие антитела из антикомплементарной сыворотки адсорбируются на комплексе и весь вновь образовавшийся комплекс «Аг вируса + Ат специфической неокрашенной противовирусной сыворотки + комплемент + антикомплементарное Ат» в результате будет ярко светиться салатно-зеленым цветом. Преимуществом данного метода является то, что при этом методе для диагностики на любое бактериальное или вирусное заболевание достаточно иметь в лаборатории лишь одну антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку и наборы специфических гипериммунных неокрашенных сывороток.
43 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Часто используется в качестве экспресс-метода для индикации и идентификации вирусов. Суть метода — амплификация, т. е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК in vitro. В этом методе действуют матричный механизм и принцип комплементарности. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновой кислоты) способны связываться водородными связями в одну двуспиральную, если последовательности нуклеотидов одной точно соответствуют последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары аденин—тимин и гуанин—цитозин.
ПЦР основана на амплификации ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймер — это фрагмент ДНК, состоящий из 20—30 нуклеотидов. Эти праймеры (затравки) комплементарны противоположным цепям ДНК. При синтезе ДНК праймеры встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК.
Обычно ПЦР ставят в 25—40 циклов. Каждый цикл включает три этапа: первый — денатурация при 92—95 °С. При этом две цепи ДНК расходятся; второй — отжиг, или присоединение праймеров при 50—65 °С; третий — элонгация, или полимеризация при 68—72 °С, при этом ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание цепей ДНК-матрицы с помощью четырех видов нуклеотидов. В результате одного цикла происходит удвоение искомого генетического материала. Образовавшиеся в первом цикле цепи ДНК служат матрицами для второго цикла и т. д. После первого цикла амплифицируется только фрагмент между двумя праймерами. Таким образом, идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25—40 циклов насинтезировать миллионы (2n) фрагментов ДНК — количество, достаточное для индикации их различными методами (методом гибридизационных зондов, содержащих определенную метку, электрофорезом и т. д.). Чаще для этой цели используют метод электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.
В ПЦР из участков ДНК возбудителя используют праймеры, которые имеют уникальную последовательность нуклеотидов, характерных только для определенного возбудителя.
Методика постановки ПЦР сводится к следующему: из исследуемого материала выделяют ДНК-матрицу; в пробирке соединяют выделенную ДНК с амплификационной смесью, в которую входят ДНК-полимераза, все 4 вида нуклеотидов, 2 вида праймеров, MgCl, буфер, деионизированная вода и минеральное масло. Затем пробирки помещают в амплификатор, и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду возбудителя. Результаты регистрируют чаще методом электрофореза в 1—2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ-лучами на трансиллюминаторе. Все процедуры ПЦР занимают 1—2 рабочих дня.
С целью повышения специфичности и чувствительности ПЦР применяют различные варианты: гнездовую ПЦР; ПЦР с «горячим стартом» с использованием парафиновой прослойки или блокады активных центров полимеразы моноклональными антителами. Кроме того, некоторые фирмы выпускают лиофилизированные наборы реагентов для проведения амплификации ДНК, которые позволяют ускорить процесс проведения ПЦР и уменьшить возможность появления ложноположительных результатов.
В настоящее время внедряется новая технология ПЦР—ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиальная особенность — мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить предъявляемые к ПЦР требования лаборатории. ПЦР в реальном времени используют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20—60 мин и теоретически способа детективировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.
Система детекции продукта в полимеразной цепной реакции «real-time» (мониторинговая ПЦР) позволяет цикл за циклом следить за накоплением амплифицированной ДНК. Система включает и себя олигонуклеотидный зонд, который способен присоединяться (гибридизироваться) к внутреннему сегменту ДНК-мишени. На 5′-конце зонд помечен флуоресцентным красителем-репортером (reporter dye), а на 3′-конце — блокатором (quencher dye). По мере накопления продукта ПЦР зонд гибридизируется к нему, однако свечения не происходит из-за близости между репортером и блокатором. В результате копирования последовательности полимераза достигает 5′-конца зонда. 5’—3′-экзонуклеазная активность полимеразы отсоединяет флуоресцентную метку с 3′-конца пробы, тем самым освобождая флуоресцирующий репортер от его связи с блокатором сигнала, что и приводит к увеличению флуоресценции. Уровень флуоресценции, таким образом, пропорционален количеству специфичного продукта реакции. Важно, что результаты ПЦР регистрируются по наличию флуоресценции в закрытых пробирках и, таким образом, решается еще одна из основных проблем этого метода — проблема контаминации ампликонами.
Достоинства ПЦР: быстрота анализа; высокие чувствительность и специфичность; минимальное количество исследуемого материала; простота в исполнении и возможность полной автоматизации.
Ввиду того что чувствительность ПЦР может достигать до детекции одной копии ДНК-матрицы, существует высокая степень опасности получения ложноположительных результатов. Поэтому генно-диагностической лабораторией при постановке ПЦР необходимо неуклонно выполнять специальные требования к планировке и режиму работы.
ПЦР является одним из дополняющих методов, существующих в вирусологической диагностике. Эта реакция очень важна для диагностики вирусных инфекций, когда вирусные антигены или вирусспецифические антитела не могут быть обнаружены и когда присутствие вирусной нуклеиновой кислоты может быть единственным свидетельством заражения, особенно при латентно протекающих и смешанных инфекциях.
44 Парвовирусы животных. Характеристика вируса Алеутской болезни норок (плазмоцитоза). Лаб.диагност плазмоцитоза. Алеутская болезнь норок (вирусный плазмоцитоз норок)-контагиозная, медленно развивающаяся инфекционная болезнь, характеризующаяся системной пролиферацией лимфоидных клеток (генерализованным плазмоцитозом), гипергаммаглобулинемией, явлениями геморрагического диатеза, артериитом, гепатитом, прогрессирующим истощением зверей, рассасыванием плодов у самок; это иммунологическое заболевание. Нет вируснейтрализующих Aт. В крови вирус циркулирует в комплексе с сывороточными иммуноглобулинами пожизненно. Сем. Parvoviridae, род Amdoparvovirus, ДНК-сод, однонитчатый без липидной оболочки. Вирус данного заболевания родства с другими парвовирусами не имеет. У беременных самок рождение мертворожденных или нежизнеспособных. Поражаются все кроветворные органы. Патизменения - гломерулонефриты, периартриты, гепатиты, лизис эр. Выделяется со слюной, мочой и фекалиями. ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ Патматериал: сыворотка крови, вн. Органы (головной мозг, мезентериальные лимфоузлы, почки, селезёнка, слюнные железы и к-к), моча инфекционны в течение всей жизни больных животных. Гистология – диффузный плазмоцитоз. I. Обнаружение Аг с помощью МФА. II. Выделение: на лаб. жив.- щенках, котятах, щенках норок; на КК из эмбриона котят, щенков, щенков норок, перев.КК почки кошки. III. Для идентификации и серологической диагностики - РИЭОФ. Неспецифические тесты-ЙАТ. Специфические методы – РИЭОФ, ИФА. Аг фреоновые экстракты печени, селезёнки, лимфатических узлов. Дифферецировать от: чумы, гепатита. Иммунитет при чуме и гепатите нестерильный, вирусоносительство до 6 мес, при АБН__иммунитета нет. Средств специфической защиты и профилактики при АБН -нет.
45 Парвовирусные энтериты собак и норок. Характеристика вирусов, методы лабораторной диагностики и средства для специфической профилактики болезни. Сем. Parvoviridae, род Parvovirus - общие свойства: l) маленькие размеры 17-28 нм, однонитчатая «+» или «-» нить ДНК, кубический тип симметрии капсида в виде икосаэдра (двадцатигранника); 2) капсид состоит из 32 капсомеров d = 2-4 нм, у Vir нет суперкапсидной оболочки; 3) высокая устойчивость во внешней среде. Термостабильны при t 56°С - 1 час; устойчивы к действию липидорастворителей и кислой среды рН 3-9; 4) репликация вирусной ДНК и сборка вирионов - в ядре клетки, тельца включения (Т-В) - внутриядерные; 5)Для репродукции парвовирусы нуждаются в быстро растущих клетках, так как только на протяжении S-фазы клеточного цикла происходит синтез клеточных ДНКполимераз, которые используются вирусом для репликации дочерних ДНК. 6) Парвовирусы пантропные проникают во все клетки, а репродуцируются в наиболее митотически активных (быстро делящихся клетках) находящихся в S-фазе клет. цикла, чем и обусловлены изменения в этих тканях (костный мозг, селезёнка, кишечник, миокард, ростки иммунокомпетен тных клеток, ткани плодов). «Тропизм» с преимуществом локализации в к-ке (много быстро делящихся клет слизист). Подсемейство Parvovirinae: - вирус энтерита кошек или панлейкопении (ПЛК); - вирус энтерита собак («олимпийка») СПВ-2, СПВ -1; - вирус энтерита норок; - Парвовирусы - человека (В19), -свиней, -КРС, - кроликов, -енотов, -гусей, -крыс, -мелкий вирус мышей. Парвовирусы вызывают у животных энтериты тонкого отдела к-ка (наблюдается понос с примесью крови, нередко рвота, лихорадка, жажда отказ от корма), гепатиты, миокардиты, геморрагическую энцефалопатию, панлейкопению (резкое снижение колва лейкоцитов), гибель эмбрионов и плодов, отставание в росте, подавляют гемато и лимфопоэз, иммунный ответ. Вирус передаётся горизонтально и вертикально. Болезнь характеризуется длительным вирусоносительством. Vir энтерита кошек, собак, норок Аg родственны, содержат 4 вида Аg выявляют в PCК, РН, РИД, РГА (агглютинируют Эr свиней). Аg для серол. диагностики парвовирусного энтерита применяют Parvovirus кошек. Для СПВ не характерна сезонность, чувствительность зависит от возраста, гибель у щенков моложе 5 мес. Для вируса энтерита кошек (панлейкопении) и энтерита норок характерна сезонность. Энтерит норок - в виде опустошительных эпизоотий – гибель от 60 до 100%. Панлекопения - в вид