(скорость ферментативных реакций)
Лабильность, то есть способность ферментов изменять активность в зависимости от различных факторов - температуры. рН среды, активаторов, ингибиторов и т. д., обусловлена, прежде всего, белковой природой ферментов. Степень изменения активности от различных факторов можно оценить по скорости ферментативной реакции.
Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, превращающегося в единицу времени, или количество образовавшегося продукта. При изучении влияния какого-либо фактора на скорость ферментативной реакции должен соблюдаться принцип единого различия, то есть все прочие факторы должны оставаться неизменными и по возможности иметь оптимальные значения.
Задание 4. Влияние температуры на активность ферментов
Температура всегда влияет на скорость реакции. В пределах физиологических условий скорость реакции растёт с увеличением температуры, но выше определенной температуры начинается тепловая инактивация белковой молекулы. Эти явления и объясняют существование температурного оптимума ферментативных реакций. Не все ферменты одинаково меняют свою активность с изменением температуры. Для большинства ферментов, выделенных из организма теплокровных, оптимальная температура равна 37-40 °С. Повышение температуры выше оптимальной приводит к уменьшению, а затем прекращению действия фермента (50-80 °С), что связано с денатурацией белков. Низкие температуры понижают скорость ферментативных реакций, доводя до минимальной величины при 0 °С.
| Реактивы: | разбавленная слюна; |
| раствор йода в йодиде калия (1:10) 0.3 %-ный (Раствор Люголя); | |
| раствор крахмала 1 %-ный; |
Ход работы.
1. В штативе расположить двумя рядами 8 пробирок (по 4 пробирки в ряду).
2. Во все пробирки первого ряда налить по 3 мл 0,2 %-ного раствора крахмала;
3. Во все пробирки другого ряда – по 1 мл разбавленной слюны.
| Растворы, условия опыта | Температура | |||
| 100 ºС (кипящая баня) | 37 ºС (термостат) | 0 ºС (лед) | 20-25 ºС (контроль) | |
| Слюна | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл |
| Крахмал 0,2 % | 3 мл | 3 мл | 3 мл | 3 мл |
| Поместить | в кипящую баню | в термостат | эксикатор со льдом | оставить в штативе на столе |
| Экспозиция 10 минут | ||||
| Слить вместе и оставить в тех же условиях, в которых находились пробирки контролируя процесс гидролиза в соответствии с пунктом 7 | ||||
| Раствор Люголя | 1-2 капли | 1-2 капли | 1-2 капли | 1-2 капли |
| Окраска с йодом | ||||
| Название обнаруженных на основании окраски с йодом продуктов |
4. Первые пробирки из обоих рядов (одна с ферментом, другая с крахмалом) поместить в кипящую водяную баню, вторые – в термостат при 37-38 °С. третьи – в лёд или снег, четвёртые оставить при комнатной температуре.
5. Через 10 минут содержимое каждой пары пробирок объединить вместе (прилить крахмал к ферменту!!!!), тщательно перемешать пробирки с содержимым и оставить в тех же температурных условиях при которых они находились. Этот момент считать началом опыта.
6. В это время взять 3 пробирки, внести в них по 1-2 капли раствора йода. Это необходимо для наблюдения за ходом гидролиза крахмала амилазой по реакции с йодом.
7. По истечении 1 минут инкубации из пробирки, стоящей при комнатной температуре, отобрать 0,2-0,3 мл инкубируемой смеси и внести её в одну из пробирок с раствором йода. При появлении синего окрашивания, все пробирки оставить в тех же условиях еще на 1 минуту, фиолетового на 30 секунд, темно вишневого - 15 секунд. После истечения этого времени реакцию с йодом повторить. В случае появления бурой окраски содержимого пробирки, стоящей при комнатной температуре, инкубацию прекратить, сразу же добавив по 1-2 капли раствора йода в каждую пробирку. Опытные пробирки из термостата и кипящей бани, предварительно охладить под струей воды.
8. Глубину гидролиза крахмала определить по окраске с раствором йода, результат записать в таблицу.
На основании полученных данных построить график скорости ферментативной реакции от температуры. При построении графика по оси ординат, начиная от нуля, обозначить цвета в следующей последовательности: синий, фиолетовый, красный (объединяя все его тона), желтый; по оси абсцисс - температуру, обозначив разрыв между 40 и 100 °С.
Сделать вывод о влиянии температуры на активность амилазы.