Большинство ферментов характерным образом изменяют свою активность в зависимости от рН. Оптимальной активности фермента соответствует определённая область рН, при которой достигается максимальная скорость реакции; уменьшение и увеличение рН приводит к снижению последней. Для различных реакций значения оптимума рН колеблются в широких пределах от сильно кислой среды до сильно щелочной.
Зависимость ферментативной активности от pН определяется значением рК ионизирующих групп белковой молекулы, особенно тех, которые находятся в активном центре или вблизи него, а также групп, ответственных за изменение состояния активного центра путём конформационных изменений белковой молекулы. Кроме того, рН может влиять на степень ионизации или пространственную организацию субстрата.
| Реактивы: | разбавленная слюна; |
| раствор йода в йодиде калия (1:10) 0.3 %-ный (Раствор Люголя); | |
| раствор крахмала 0,2 %-ный; | |
| растворы с заданными значениями рН и растворы для приготовления смесей с определенным рН |
Приготовление буферных растворов с различными значениями рН среды
(берете готовые на лабораторном столе)
| № пробирки | 0,2 М растворы фосфата натрия, мл | Значение рН смеси | |
| Раствор 1. Двузамещенный | Раствор 2. Однозамещенный | ||
| 2,5 | 47,5 | 5,8 | |
| 6,2 | |||
| 7,0 | |||
| 7,4 | |||
| 47,5 | 2,5 | 8,0 |
Буферные растворы готовятся лаборантом 1 раз на весь поток. После смешивания фактическое значение рН определить на рН-метре. Добавлением раствора № 1 или № 2 максимально приблизить к заданной рН.
Ход работы.
1. В штативе расположить 5 пробирок.
2. Во все пробирки налить по 2 мл соответствующего буферного раствора, меняя наконечники или промывая пипетку.
3. Во все пробирки прилить по 2 мл 0,2 %-ного раствора крахмала;
4. Взять отдельно 3 пробирки, внести в них по 1-2 капли раствора йода. Это необходимо для наблюдения за ходом гидролиза крахмала амилазой по реакции с йодом
5. Во все пробирки добавить по 0,5 мл разбавленной слюны.
6. По истечении 1 минут инкубации из средней пробирки с рН=7, отобрать 0,2-0,3 мл инкубируемой смеси и внести её в одну из пробирок с раствором йода. При появлении синего окрашивания, все пробирки оставить в тех же условиях еще на 1 минуту, фиолетового на 30 секунд, темно вишневого - 15 секунд. После истечения этого времени реакцию с йодом повторить. В случае появления бурой окраски ровно через 15 секунд инкубацию прекратить, сразу же добавив по 1-2 капли раствора йода в каждую пробирку. Опытные пробирки из термостата и кипящей бани, предварительно охладить под струей воды.
| Растворы, условия опыта | рН среды | ||||
| 5,8 | 6,2 | 7,0 | 7,4 | 8,0 | |
| Буферный раствор | 2 мл | 2 мл | 2мл | 2 мл | 2 мл |
| Крахмал 0,2 % | 2 мл | 2 мл | 2 мл | 2 мл | 2 мл |
| Слюна | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл |
| Контролировать ход гидролиза крахмала по реакции с йодом в соответствии с пунктом 6 | |||||
| Раствор Люголя | 1-2 капли | 1-2 капли | 1-2 капли | 1-2 капли | 1-2 капли |
| Окраска с йодом | |||||
| Название обнаруженных на основании окраски с йодом продуктов |
7. Глубину гидролиза крахмала определить по окраске с раствором йода, результат записать в таблицу.
По результатам работы построить график зависимости активности амилазы слюны от рН и сделать вывод. При построении графика по оси ординат, начиная от нуля, обозначить цвета в следующей последовательности: синий, фиолетовый, красный (объединяя все его тона), желтый; по оси абсцисс - рН.
Сделать вывод о влиянии рН на активность амилазы
Задание 6. Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов
Активность большинства ферментов в значительной степени зависит от природы и концентрации некоторых ионов и низкомолекулярных веществ (могут быть промежуточные или конечные метаболиты реакций), присутствующих в биологической жидкости. Одни из них - активаторы - повышают активность ферментов, другие – ингибиторы угнетают действие ферментов. Механизм их действия может быть аллостерическим или конкурентным.
| Реактивы: | разбавленная слюна; |
| раствор йода в йодиде калия (1:10) 0.3 %-ный (Раствор Люголя); | |
| раствор крахмала 1 %-ный; | |
| хлорида натрия 1 %-ный | |
| сульфата меди (II) 1 %-ный |
Ход работы.
1. В штативе расположить 3 пробирки.
2. Во все пробирки налить по 1 мл разбавленной слюны.
3. В первую пробирку добавить 1 мл NaCl (1%), во вторую пробирку добавить 1 мл CuSO4, а в третью 1 мл дистиллированной воды в соответствии с таблицей.
4. Взять отдельно 3 пробирки, внести в них по 1-2 капли раствора йода. Это необходимо для наблюдения за ходом гидролиза крахмала амилазой по реакции с йодом.
5. Во все пробирки добавить по 1 мл 0,2 % крахмала.
| Растворы, условия опыта | Количество растворов | |||||
| Контроль | Опыт 1 | Опыт 2 | Опыт 3 | Опыт 4 | Опыт 5 | |
| Слюна | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл |
| Вода | 1 мл | |||||
| NaCl 1% | 1 мл | |||||
| KCl 1% | 1 мл | |||||
| MgCl2 1% | 1 мл | |||||
| Na2SO4 1% | 1 мл | |||||
| CuSO4 1% | 1 мл | |||||
| Крахмал 0,2% | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл |
| Контролировать ход гидролиза крахмала по реакции с йодом в соответствии с пунктом 6 | ||||||
| Раствор Люголя | 1-2 капли | 1-2капли | 1-2капли | 1-2капли | 1-2капли | 1-2капли |
| Окраска с йодом | ||||||
| Название обнаруженных на основании окраски с йодом продуктов |
6. По истечении 1 минуты инкубации из контрольной пробирки с водой отобрать 0,2-0,3 мл инкубируемой смеси и внести её в одну из пробирок с раствором йода. При появлении синего окрашивания, все пробирки оставить в тех же условиях еще на 1 минуту, фиолетового на 30 секунд, темно вишневого - 15 секунд. После истечения этого времени реакцию с йодом повторить. В случае появления бурой окраски инкубацию прекратить, сразу же добавив по 1-2 капли раствора йода в каждую пробирку.
7. Глубину гидролиза крахмала определить по окраске с раствором йода, результат записать в таблицу.