4.2.1 Определение содержания МАФАМ.
При исследовании пастеризованное молоко разводят стерильным физиологическим раствором в соотношениях 1:10; 1:100, 1:1000 и вносят по 1,0 см3 в чашку Петри и заливают расплавленным и остуженным МПА, перемешивают и инкубируют трое суток при 30 оС, затем подсчитывают число выросших колоний по формуле:
X = n10m
где Х - количество МАФАМ в 1 см3
n - количество колоний
m – степень разведения
Норматив. Количество МАФАМ для пастеризованного молока в потребительской таре должно быть не должно превышать 105 КОЕ/см3.
4.2.2. Определение БГКП.
Пастеризованное молоко разводят физиологическим раствором в соотношении 1:10; 1:100 и засевают по 1 см3 в 3 пробирки со средой Кесслера с поплавками: В 1 пробирку вносят 1 см3 цельного молока; во 2 пробирку — 1 см3 из разведения 1:10 и в 3-ю — 1 см3 из разведения1:100. Термостатируют 18-24 часа при 37 оС. При отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии в нем БГКП. При наличии газообразовании отмечают, что БГКП в нем обнаружены.
Норматив. БГКП не должны обнаруживаться в 0,01 см3 пастеризованного молока.
4.2.3. Выявление сальмонелл.
По ГОСТу определения сальмонелл не проводят, но согласно СанПиН в 25 граммах продукта сальмонеллы должны отсутствовать. Поэтому выявление бактерий рода сальмонелл, необходимо проводить по ГОСТ Р 52814 – 2007. Пробы засевают на забуференную пептонную воду в соотношении 1:9. Инкубируют 24 часа при 37оС. Затем делают высев по 1 см3 в 2 среды обогащения: RVS (Раппопорта-Вессилиадиса с соей) и тетратионатный бульон либо селенитовый бульон или Мюллера-Кауфмана). Среду RVS (Раппопорта-Вессилиадиса с соей) инкубируют 41 оС-24 часа, а селенитовый бульон или Мюллера-Кауфмана 24 часа 37 оС. Через 24 часа делают пересев на среды: XLD (ксилоза-лизин декстрозный агар) и Эндо, Левина или Плоскирева. Термостатируют 24 часа при 37 оС и учитывают характер роста (сальмонеллы образуют на среде Эндо колонии S-формы бесцветные или розовые) и делают отсев на скошенный МПА. Пробирки инкубируют 24 часа 37 оС.
Через 24 часа ставят реакцию агглютинации (РА) на стекле с поливалентными сальмонеллезными сыворотками А, В, С, D и Е. В случае положительной реакции ставят РА с групповыми сыворотками. Одновременно с РА материал засевают на среду Олькеницкого и изучают другие биохимические свойства путем посева на среды Гисса и МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород. После инкубации (24 часа 37 оС) отмечают характер роста микроорганизмов. Сальмонеллы подвижными, не расщепляют лактозу и сахарозу, расщепляют глюкозу, образуют H2S и не образуют индол. У выделенной чистой культуры бактерий изучают другие биохимические свойства путем посева на среды Гисса и МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород.
Для определения серовара сальмонелл используют РА с моновалентными О- и Н- сальмонеллезными сыворотками.Обнаружение микроорганизмов, образующих характерные колонии на средах XLD и Эндо, имеющих характерные морфологические, биохимические и антигенные свойства, указывает на присутствие в исследуемом пищевом продукте сальмонелл.
Норматив. Сальмонеллы должны отсутствовать в 25 см3 молока.
4.2.4. Выявление Staphylococcus aureus.
Проводят в соответствии с ГОСТом 303447 – 97 «Молоко и молочные продукты».
Определение S. аureus в определенном объеме продукта с предварительным обогащением. Из ранее приготовленных разведений, используем ту массу, в которой по нормативному документу S. aureus должен отсутствовать. Например: в молоке пастеризованном в потребительской таре наличие S. aureus не допускается в 1,0 см3.
Для выявления S. aureus 1 см3 цельного продукта вносят в пробирки с солевым бульоном (1:10), инкубируют при 24 часа 37 оС. Через 24 часа отсевают на среду Бэйрд – Паркера (ЖСА, МСА). Инкубируют 24-48 часов при 37ооС, готовят мазки и отсевают характерные колонии на МПА. Посевы инкубируют 24 часа при 37 оС, а затем ставят пробу на плазмокоагулазу.
Наличие характерных морфологических, культурных свойств и положительной реакции плазмокоагуляции свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в определенном объеме.
Норматив: золотистых стафилококков не должно быть в 1см3 пастеризованного молока в потребительской таре.
4.2.5. Определение листерий.
Исследование включает несколько этапов:
1-й этап. Для определения листерий подготовленную навеску продукта (25 г/см3) вносят в среду для первичного обогащения в количестве 225 мл (ПБЛ 1 — питательный бульон для листерий) и инкубируют 24 часа при 37 оС.
2-й этап. Затем 0,1 см3суспензии из молока пересевают в 10 см3 среду вторичного обогащения (ПБЛ 2) и инкубируют 48 часов при 37 оС.
3-й этап. Через 48 часов из пробирок независимо от наличия или отсутствия признаков роста отсевают 0,1 см3 на поверхность двух чашек с ПАЛ (РАLСАМ) агаром инкубируют 24-28 часов при 37 С.
Примечание: допустимо не проводить второй этап (этап вторичного обсеменения) при посеве с низким исходным уровнем микробной контаминации и при отсутствии признаков роста в жидкой среде первого этапа, т.е. переходить сразу к посеву на агаризованные среды.
4-й этап. Изучают характер роста: на среде PALCAM — через 24 часа листерии формируют мелкие, серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, диаметром 0,5-1,0 мм., иногда с черным центром. Через 48 часов их диаметр равен 1,0-2,0 мм.; колонии становятся зелеными с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая флора образует желтые колонии за счет ферментации маннита. Отобранные колонии (3-5) пересевают на МПА, дополненный 1% глюкозы. Посевы инкубируют посевы 24 часа при температуре 30 о С.
5-й этап. Включает:
а) микроскопию (грамположительные тонкие короткие палочки, спор не образуют).
б) определение каталазной активности (положительны)
в) определение подвижности посевом уколом на полужидкий агар PALCAM в 2 пробирки. Одну инкубируют при 25 оС, другую при 37 о С 48-72 часов. При 20-25 оС подвижны, характер роста напоминает зонтик; неподвижны при 35-37 оС.
г) определение способности восстанавливать нитраты.
д) определение ферментации углеводов. Проводят посев на пестрый ряд (не утилизируют маннит, ксилозу; утилизируют рамнозу с образование кислоты) при 37 о С в течении 7 дней.
е) Определение гемолитической активности на кровяном агаре (образует зону гемолиза вокруг колоний)
Норматив. Наличие листерии не допускаются в 25 г или см3 продукта.
4.2.6. Определение редуктазной активности.
Проводят при исследовании сырого молока. Метод основан на способности восстанавливать метиленовый голубой ферментами, выделяемыми микроорганизмами, присутствующими в молоке. По продолжительности изменения окраски оценивают бактериальную обсемененность сырого молока. Чем медленнее процесс, тем меньше микроорганизмов в молоке, тем лучше его качество.
4.2.7. Проба на брожение.
Применяют при определении пригодности молока для производства сыра. Метод основан на способности некоторых микроорганизмов, присутствующих в молоке, свертывать его. Чем медленнее происходит образование сгустка без выделения сыворотки и пузырьков газа, тем лучше качество молока.