Технология получения и поддержания клеточных культур
Технология выделения и культивирования клеток различного гистогенеза сложилась на протяжении последних 100 лет. Еще в начале прошлого века были начаты исследования структуры и функции фрагментов тканей in vitro при их переживании в различных биологически активных жидкостях организма, таких как плазма и сыворотка крови. В некоторых случаях из таких кусочков мигрировали клетки, в основном фибробласты. За указанный период сложилась технология выделения и культивирования клеток, которая продолжает развиваться и в настоящее время.
Чтобы лучше себе представить основы создания такой технологии, обратимся к одной из современных схем.
Схема выделения монослойных клеток из соединительной или мышечной ткани
Получение стерильной ткани
|
Диссоциация ткани
(механическая, ферментативная, с помощью хелатирующих агентов либо комбинации различных обработок ткани)
|
Инактивация протеаз в полученной суспензии клеток (добавление 5% сыворотки крови) и освобождение клеток от остатков ткани (фильтрование через нейлоновый фильтр)
|
Осаждение клеток (центрифугирование – 200g, 5-10 мин.)
|
Суспендирование клеток в ростовой среде (питательная среда + 2-20% сыворотки крови + цитокины, белки адгезии, ростовые факторы)
|
Подсчет концентрации клеток в гемоцитометре
|
Количественный высев клеток в сосуд для культивирования
|
Культивирование клеток в СО2 – инкубаторе (370С, 95% воздуха, 5% СО2)
Помимо монослойных были получены суспензионные клеточные культуры гемопоэтических клеток крови и костного мозга, схема выделения которых содержит механическую диссоциацию в сочетании с различными методами их фракционирования (градиентное центрифугирование, цитоиммуноферрез). После получения суспензии клеток их аналогично с монослойными клетками количественно высевают в стерильных условиях в специальных ростовых средах в сосуды для культивирования, которые помещают в термостат.
|
|
Из представленной схемы следует, что для любых типов клеток необходимо обеспечить самые важные условия их существования в организме: постоянную температуру, стерильность, питательную среду (жидкую фазу), газовую фазу (смесь воздуха и СО2) и твердую фазу (поверхность сосуда для культивирования). Эти условия были созданы с помощью:
- установок, обеспечивающих стерильную работу (ламинар-боксы, создающие поток обеспыленного стерильного воздуха);
- специальной стерильной посуды «для культур клеток» (из специально подготовленного и имеющего определенный заряд поверхности пластика);
- термостатов, обеспечивающих постоянные температуру (для теплокровных 370 С), влажность и газовый состав (наиболее часто: 95% воздуха, 5% СО2);
- смеси стерильных стандартных питательных сред постоянного химического состава и биологически активных комплексных препаратов, таких как сыворотка крови, ее фракции и отдельные биологически активные компоненты (цитокины, ростовые факторы, гормоны).
В настоящее время существует большое количество крупных фирм, производящих все необходимое для получения и поддержания клеточных культур. Первые три из перечисленных условий обеспечивают только стерильность и стандартность культивирования клеток.
|
|
Среды для клеточных культур с указанными в схеме добавками являются кроме того ключевыми факторами, регулирующими различные аспекты функциональной активности клеток в культуре (адгезию, миграцию, пролиферацию, дифференцировку). Поэтому остановимся подробнее на принципах разработки и на составе питательных сред для культивирования клеток.
Стандартные питательные среды постоянного химического состава (осмотическое давление, рН, буферная емкость, основные компоненты)
Долгое время в качестве жидкой фазы для культивирования клеток использовали плазму крови, тканевые экстракты, а затем сыворотку крови. Все эти комплексные препараты стимулировали как пролиферацию, так и разрушение различных типов клеток и при этом имели нестабильный химический состав. На пути совершенствования среды для культивирования клеток было обнаружено, что одним из главных условий сохранения жизнеспособности и функциональной активности клеток является поддержание в среде определенных пределов концентрации водородных ионов (рН) и осмотического давления. Эту функцию выполняет сбалансированный солевой раствор, лежащий в основе питательной среды и содержащий смесь солей Na, K, Ca, дополненную углеводом в качестве источника энергии. В основе многих питательных сред лежат солевые растворы Эрла и Хенкса. Растворы Эрла и Хенкса, а также фосфатно-солевой буфер Дальбекко широко используют также для промывания клеток и для приготовления диссоциирующих растворов.
Осмотическое давление солевых растворов и питательных сред определяется числом молей осмотически активных частиц (ионов и неионизированных молекул) растворенных веществ на 1 кг растворителя (осмоляльность) или на 1 л раствора (осмолярность). В разбавленных водных растворах эти величины близки. Общую осмоляльность раствора (осмоль/кг) можно представить в виде суммы å mixi (i=1-n), mi – концентрация i-го растворенного вещества (моль/кг), xi – количество частиц, на которое диссоциирует его молекула, n – количество веществ. Например, для раствора Эрла расчетная величина осмоляльности составляет 310,6 мосмоль/кг, а реальная, полученная из данных по определению снижения точки замерзания, - 283 мосмоль/ кг. Осмоляльность растворов измеряют с помощью осмометров – приборов, основанных на сравнении точек замерзания исследуемого и колибровочного раствора.
|
|
В большинстве сред, как и в крови, в качестве главного компонента системы, поддерживающей рН, используется бикарбонатный буфер. В растворе бикарбоната осуществляется равновесие НСО3 = СО2 + ОН. Если СО2 уходит из раствора, то равновесие сдвигается вправо и пропорционально концентрации бикарбоната увеличивается число гидроксильных ионов. Растворы с бикарбонатным буфером можно разделить на 2 группы: с низким (Хенкса) и высоким (Эрла) содержанием бикарбоната. При работе с растворами, содержащими много бикарбоната, необходимо вести культивирование при высоком содержании в воздухе СО2, что возможно только в специальных сосудах (чашки Петри, специальные платы и флаконы с перфорированными крышками) в СО2- инкубаторе.
Пределы рН и осмоляльности, в которых происходит размножение клеток, довольно узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Для диплоидных фибробластов человека линии WI38 оптимальны рН 7.3±0.15 и осмоляльность 285±40 мосмоль/кг, а для фибробластов из эмбриона цыпленка – 7.12±0.18 и 300±20 мосмоль/кг.
Технические трудности, а также проблемы, связанные со значительными изменениями рН при работе с клеточными культурами вне СО2-инкубатора, стимулируют поиск альтернативных буферных систем. Например, можно поддерживать рН, повышая концентрацию аминокислот, а также заменяя бикарбонат ß-глицерофосфатом и различными синтетическими органическими буферами, из которых наиболее широкое распространение получил HEPES – буфер –соль 2,4-оксиэтил-1-пиридинэтансульфоновой кислоты (рН 7,2-7,4 при 37ºС). Он обычно используется в концентрации 0,01-0,03 моля. Добавляя к стандартным средам HEPES и другие буферы, надо учитывать их вклад в общую осмоляльность: 0,05М HEPES увеличит осмоляльность более чем на 50 мосмоль/кг.
Исследование биохимического состава биологически активных натуральных жидкостей для культивирования клеток, в первую очередь сыворотки и плазмы крови, привело к выделению двух основных групп компонентов сред: низкомолекулярных (аминокислоты, витамины, нуклеотиды) и высокомолекулярных (липиды, углеводы, белки, гликопротеины). На базе сбалансированных солевых растворов в комплексе с различными аминокислотами, витаминами, жирными кислотами, микроэлементами, индикатором рН были разработаны питательные среды постоянного химического состава для различных клеточных культур. Начиная с конца 40-х годов, исследования в этом направлении вели в нескольких лабораториях США и Англии. Одними из первых успехов добились Parker (1950 – среда 199), Eagle (1959 – среды MEM), Dulbecco (1959 – среда DMEM), а затем Ham (1963,65 – среды F10, F12) и Kitamura (1968 – среда RPMI1640). В настоящее время существует более 20 основных базовых сред постоянного химического состава, разработанных на основе указанных выше сред. Эти среды называются стандартными питательными средами. Основными компонентами сред являются аминокислоты (12-25наименований – н.), витамины (8-17н.), соли (6-10н.), сахара (1-3н.), основания нуклеиновых кислот: нуклеозиды, нуклеотиды (0-7н.), а также липиды, индикатор рН и др. компоненты (1-5н.). Одной из наиболее бедных по ассортименту компонентов является среда МЕМ (minimum essential medium), разработанная под руководством Eagle как минимальная (~30 компонентов – к.), наиболее богаты по ассортименту среды Хэма- F10, F12 (~50 к.), а также среда 199 (~60 к.). Большинство стандартных питательных сред основаны на бикарбонатной буферной системе. В некоторых случаях в них вводят для увеличения буферной емкости HEPES-буфер. Исключение составляет среда L15 (разработана Leibovits), где буферную емкость обеспечивают аминокислоты. Большинство стандартных питательных сред имеют рН 7.2-7.4, а осмоляльность 280 – 320 мосмоль/кг.
Состав питательных сред, ссылки на их разработчиков, особенности их приготовления приводят во всех каталогах фирм-производителей, таких как Life Technologies-GibcoBRL, ICN, Sigma, Serva и др. Среды выпускают как стерильные сухие, так и жидкие. Срок хранения жидких сред 1 год, сухих 2-3 года при соблюдении условий хранения. Возможность выпуска сухих питательных сред связана с получением тщательно обезвоженных и перемешанных в шаровой мельнице смесей всех компонентов и дальнейшей их герметичной упаковкой в атмосфере азота. Для приготовления жидких сред из таких смесей помимо сухого порошка стандартной питательной среды необходима особо чистая вода (сопротивление 18MgOm), бикарбонат Na, разбавленные соляная кислота и щелочь для подведения рН, осмометр, рН-метр, установка для стерильного фильтрования сред (фирмы Millipore и других), основанного на пропускании среды через систему стерильных мембранных фильтров из нитроцеллюлозы с минимальным диаметром пор 0,2 ммк.