При культвировании клеток используют питательные среды постоянного химического состава в комплексе с сывороткой и другими биологически активными компонентами.
В зависимости от задачи исследования культуральные среды можно разделить на ростовые (обеспечивающие пролиферацию клеток), транспортные (обеспечивающие жизнеспособность клеток при транспортировке), поддерживающие (обеспечивающие жизнеспособность и функциональную активность клеток в стационарной фазе роста), а также дифференцировочные (вызывающие направленную дифференцировку клеток). Перечисленные среды содержат 1-20% сыворотки крови или могут быть бессывороточными.
Сыворотка крови - одна из наиболее универсальных биологически активных жидкостей - незаменима при культивировании клеток. Особенно это касается эмбриональной сыворотки различных биологических видов. Сыворотку получают из цельной крови в процессе формирования фибринового сгустка. Наиболее широко используют сыворотку крови плодов коров (СЭК). Аналогично питательным средам и другим растворам для культивирования клеток сыворотку стерилизуют путем фильтрования через систему стерильных мембранных фильтров из нитроцеллюлозы, помещенных в специальный фильтродержатель (Millipore, США). Сыворотка играет следующую роль в процессе культивирования клеток:
- обеспечивает клетки гормональными и ростовыми факторами, стимулирующими их рост и функции;
- обеспечивает клетки факторами, необходимыми для их прикрепления и распластывания;
- обеспечивает клетки транспортными белками, переносящими гормоны, минеральные вещества, липиды и т.д.
Сыворотка, особенно СЭК, незаменима при культивировании практически всех типов клеток. Например, для пролиферации стромальных (мезенхимальных) клеток костного мозга – СККМ (МСК), оптимальна питательная среда αMEM c добавлением 10-20% отселектированной для этого типа клеток СЭК, либо для фракции этих клеток – мезодермальных предшественников – оптимальна среда, состоящая из смеси сред MCDB и DMEM с добавлением 2% СЭК, а также факторов роста, дексаметазона и других в сочетании с культивированием этих клеток на подложке из фибронектина. В настоящее время фирмы-производители сывороток тестируют их и в дальнейшем рекомендуют для культивирования определенных типов клеток: СККМ (МСК), гибридом, фибробластов.
|
|
Однако использование сыворотки имеет ряд существенных недостатков. К ним относятся следующие факторы:
1). Для большинства клеток сыворотка не является физиологической жидкостью, с которой они контактировали в исходной ткани. Такой контакт мог осуществляться в процессе заживления ран и образования кровяных сгустков. При этом сыворотка вызывает рост фибробластов.
2). Сыворотка может быть цитотоксичной из-за присутствия селективных ингибиторов, бактериальных токсинов, некоторых липидов, а также ферментов типа полиаминооксидазы.
3). Активность сыворотки меняется от партии к партии.
4). Сыворотка может содержать недостаточное количество специфических для данных клеток ростовых факторов, что приводит к необходимости добавления этих факторов к культуральным средам.
. Частично указанные недостатки можно компенсировать с помощью бессывороточных сред.
Бессывороточные среды
|
|
В зависимости от поставленной в работе задачи (например, оптимизация процесса дифференцировки клеток, поддержание клеток в стационарной фазе роста) и типа клеток (суспензионные или монослойные) применяют бессывороточные среды различного состава. Они имеют следующие преимущества:
1). Обеспечивают улучшение воспроизводимости результатов опытов вследствие большей стабильности состава среды.
2). Снижают риск заражения культуры вирусами, грибами, микоплазмой.
3). Облегчают очистку продуктов клеточного метаболизма.
4). Не содержат цитотоксических примесей.
Переход к бессывороточной среде осуществляют по-разному: ступенчато снижая количество сыворотки в среде и вводя ее заменитель, либо в один прием, замещая сыворотку ее заменителем, либо культивируя клетки непосредственно в питательной среде с включенными в нее необходимыми компонентами. Тот или иной подход зависит от поставленной задачи. Наиболее часто используют последний из перечисленных подходов. Он сводится к добавлению непосредственно в питательную среду различных комбинаций ростовых факторов и других незаменимых компонентов, выполняющих функцию сыворотки: гормонов, транспортных белков и факторов прикрепления. Применяют бессывороточное культивирование, как правило, при работе с клетками-продуцентами, когда необходимо в дальнейшем выделять из культуральной среды или из клеточной массы биологически активные продукты жизнедеятельности клеток. Кроме того, бессывороточное культивирование используют при изучении дифференцировки и пролиферации клеток в культуре. Остановимся на примерах бессывороточных сред для разных типов клеток:
|
|
1). Для гибридом (на стационарной фазе роста с целью очистки продуцируемых клетками антител) и миелом (для исследования пролиферации):
среды Искова (Iskov’s: IMDM);
DMEM/F12 + ITESA (insulin, transferrin, ethanolamine, selenite,
albumin);
DMEM/F12 + безбелковый заменитель сыворотки (гидрокортизон и
микроэлементы).
2). Для диплоидных фибробластов человека (на стационарной фазе роста с целью анализа продуцируемых компонентов, иногда – для изучения пролиферации):
DMEM/199+ ITESA, ФРЭ- фактор роста эпидермиса, дексаметазон,
фибронектин, путресцин, фетуин, молибдат.
3). Для кератиноцитов человека (для обеспечения их пролиферации):
MCDB104 + IE, ФРЭ, гидрокортизон, фосфоэтаноламин.
Таким образом, среды 1, 2 можно использовать как ростовые, так и переживающие. Среда 3 – ростовая. В транспортные бессывороточные среды на базе стандартных питательных сред (DMEM, MEM, RPMI1640, αMEM) добавляют BSA (бычий сывороточный альбумин) и некоторые другие компоненты, повышающие жизнеспособность клеток при их транспортировке.
Для дифференцировки СККМ в хондрогенном направлении была разработана бессыворточная среда, состоящая из DMEM + ITS, TGFβ, BSA, LA, дексаметазон, аскорбиновая кислота, пролин, пируват.
К недостаткам бессывороточных сред можно отнести следующее:
1). Бессывороточная (б/с) среда не универсальна и пригодна только для одного типа клеток, для конкретной задачи.
2). В б/с средах клетки имеют пониженную жизнеспособность.
3). При пересевах монослойных культур необходимо использовать ингибиторы протеаз.
Однако то, что бессывороточные среды не универсальны и разработаны для определенных типов клеток и определенных задач их культивирования является, с одной стороны, недостатком, а с другой стороны, достоинством, обеспечивающим тонкую регуляцию активности клеток.