Казеин является главным белком молока всех млекопитающих, основной белковой группой коровьего молока. Относится к белковому запасу, принадлежит к фракции белков, называемых фосфопротеидами. Один из наиболее ценных пищевых белков, содержащий все незаменимые аминокислоты. Содержание его в коровьем молоке примерно 80% (~78-87%) от всех белков. Основными компонентами казеина являются α s1-, β-, χ-, γ-казеин. Казеины α и β-наиболее чувствительные к ионам Ca, γ-казеин ионами Ca не осаждается, однако γ-казеин содержит чувствительную к сычужному ферменту пептидную связь, образованную остатками фенилаланина и метионина.
Казеин, как и любой другой белок, распадается при термической обработке, однако он гораздо более термоустойчив. Для его разрушения необходимо температурное воздействие в 130 градусов Цельсия. Также, казеин образован из большого числа различных аминокислот, объединенных друг с другом в полипептидной цепи, но содержит также множество фосфатных групп, которые и связывают кальций (казеинат кальция, соль кальция). В молоке казеин находится не в свободном виде, а в виде казеинаткальцийфосфатного комплекса – ККФК.
Казеинаткальцийфосфатный комплекс образует мицеллы сферической формы, состоящие из субмицелл. Нативные мицеллы казеина имеют на поверхности общий отрицательный заряд и прочную гидратную оболочку, что в заметной степени обусловливает их устойчивость в молоке. Такой вид казеина иногда именуется как казеиноген.
При прокисании молоко сворачивается, и казеин осаждается в форме творожного сгустка. Свёртывание казеина в молоке протекает под влиянием протеолитических ферментов сычужного сока, кислот, вырабатываемых молочнокислыми бактериями, либо при прямой добавке кислот (технический казеин).
Казеин получают разными способами. Важный фактор, определяющий промышленное получение казеина, является его растворимость в различных растворах. Казеин растворим в разбавленных растворах щелочей и в сильных кислотах, однако нерастворим в разбавленных кислотах, где он выпадает в осадок. Для производства казеина применяется свежее обезжиренное молоко. Удаление жира в молоке происходит с помощью центрифугирования, после чего в него добавляют слабощелочной раствор. Для отделения малейших следов жира снова центрифугируют и приливают разбавленный раствор кислоты, чтобы добиться максимально полного выпадения казеина в осадок. Образовавшийся творожный сгусток промывают для удаления кислоты и высушивают при низкой температуре, поскольку казеин чувствителен к нагреванию.
Существуют четыре основных метода определения массовой доли белка в молоке и молочных продуктах:
– Метод Кьельдаля
– Рефрактометрический метод
– Колориметрический метод
– Метод формольного титрования
ГОСТ 25179-2014 устанавливает методы определения массовой доли белка в колориметрическом методе и в методе формольного титрования. ГОСТ 53951-2010, а так же ГОСТ 23327-98 регулируют измерение массовой доли белка по Кьельдалю.
Метод Кьельдаля
Данный метод основывается на сжигании органических компонентов молочной пробы в колбе Кьельдаля с добавлением серной кислоты в присутствии катализатора сульфата меди. Определяют массовую долю азота, который в ходе реакции освобождается. Массовую долю белка находят, умножая полученный результат на соответствующий коэффициент.
Массовую долю азота определяют следующими способами:
– Электрохимический. Кулонометрическое титрование аммиака происходит автоматически в минерализованной пробе.
– Химический. Раствор подщелачивается, аммиак с водяным паром дистиллируется, с поглощением его раствором борной кислоты и титрованием последнего раствором соляной кислоты. Индикация точки эквивалентности происходит по изменению окраски индикатора или с помощью потенциометрического анализатора.
Измерения проводится с добавлением, в колбу Кьельдаля, нескольких кусочков фарфора, примерно 10 г. сульфата калия, 0,04 г. сульфата меди. Молочную пробу отмеривают в бюксу с крышкой в количестве 5 см³, крышку закрывают и взвешивают. Перелив молоко из бюксы в колбу, пустую бюксу взвешивают и по разнице определяют массу взятого молока. В колбу с молоком осторожно по стеночкам, тем самым смывая молоко со стенок колбы, добавляют 20 см³ серной кислоты. Колбу закрывают, содержимое с осторожностью перемешивают.
Колбу устанавливают на нагревательный прибор под углом в 45º и осторожно, нагревают до тех пор, пока не прекратится бурное вспенивание и содержимое колбы не станет жидким. Далее процесс продолжают при более интенсивном нагревании. Кипящая кислота должна конденсироваться в середине горловины колбы Кьельдаля. Степень нагревания считается достаточной, когда жидкость становится прозрачной, бесцветной (при применении в качестве катализатора окиси ртути) или слегка голубоватой (при применении в качестве катализатора сульфата меди).
Как только раствор обесцветится, нагревание следует продолжать в течение 1,5 часа. После чего колбе необходимо дать остыть до комнатной температуры. Как только температура достигнет комнатной, доливают 150 см³ дистиллированной воды и вносят несколько кусочков свежепрокаленной пемзы, перемешивают, и снова остужают.
В коническую колбу отмеривают 50 см³ раствора борной кислоты, добавляют 4 капли индикатора и перемешивают.
Собирают установку:
Коническую колбу с борной кислотой устанавливают под холодильником, и соединяют при помощи аллонжа и резиновой трубки, при условии,что конец аллонжа должен быть погружен в кислоту. Колбу Кьельдаля соединяют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Отмеряют 80 см³ раствора гидроксида натрия и приливают его через делительную воронку в колбу Кьельдаля. Кран делительной воронки закрывают незамедлительно для избегания потери образующегося аммиака. Содержимое колбы Кьельдаля круговыми движениями осторожно смешивают и доводят до кипения. Пенообразования следует избегать.
В холодильнике происходит конденсация паров раствора аммиака, которые попадают в колбу с раствором борной кислоты. Перегонка продолжается пока жидкость не начнет бурлить. Степень нагрева регулируется так, чтобы время дистилляции было не менее 20 минут. Борная кислота в процессе принимает зеленую окраску. Полнота перегонки аммиака проверяется путем дополнительной перегонки в новую порцию борной кислоты (20 см³) в течение 5 минут. Окраска раствора борной кислоты не должна меняться. При перегонке не допускается нагревания раствора борной кислоты. Слишком сильное охлаждение (как правило, ниже 10ºС) недопустимо, оно может вызвать переход жидкости из конической колбы в колбу Кьельдаля. По окончании перегонки аллонж вынимают из раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 минут. После прекращения нагревания отсоединяют аллонж. Поверхности аллонжа промываются небольшим количеством дистиллированной воды, сливая ее в коническую колбу. Дистиллят титруют раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в серый. При избытке титранта раствор приобретает фиолетовый цвет.
Параллельно основному проводят контрольный опыт, применяя 5 см³ дистиллированной воды вместо молочной пробы. Контрольный опыт необходимо повторить не менее 5 раз. По объему аммиака, определяемого титрованием, устанавливают количество общего азота. При умножении количества азота на принятый коэффициент 6,38 для молока; 6,25 для молокосодержащих продуктов; 6,28 для сыворотки, таким образом, находят содержание общего белка в молоке.