ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4
Цель работы:
Изучить влияние факторов внешней среды (рН среды, температуры и концентрации) на развитие микроорганизмов.
Задачи:
Занятие 1
1. Сделать посев бактерий на питательных средах с различным значением рН.
2. Сделать посев бактерий на питательных средах с различной концентрацией хлорида натрия.
3. Воздействовать на спорообразующие и неспорообразующие бактерии высокой температурой и сделать их посевы.
4. Сделать посевы плесневых грибов на питательных средах и вырастить их при различных температурах.
5. Сделать посев плесневых грибов или дрожжей на питательных средах с различной концентрацией глюкозы.
Занятие 2
6. Провести оценку интенсивности роста бактерий на питательных средах с различным значением рН.
7. Провести оценку интенсивности роста бактерий на питательных средах с различной концентрацией хлорида натрия.
8. Провести оценку интенсивности роста бактерий после воздействия на них высокой температуры.
9. Из выросших культур приготовить мазки и окрасить их по Граму.
10. Промикроскопировать препарат и установить форму бактерий.
11. Провести оценку интенсивности роста и спорообразования плесневого гриба при различных температурах выращивания.
12. Провести оценку интенсивности роста плесневого гриба или дрожжей на питательных средах с различной концентрацией глюкозы.
13. Определить по ключу родовое название изучаемого плесневого гриба.
Материалы и оборудование: Стерильные пробирки, термостат, микроскоп, водяная баня, пипетки Пастера, штатив, сухое горючее, 60%р-р глюкозы, 5%,10%, 20%р-ры хлорида натрия, рН метр, чашки Петри, питательная среда.
Теоретическая часть
В естественных условиях микроорганизмы подвергаются воздействию разных по своей природе факторов, которые могут как стимулировать, так и тормозить их развитие (замедлять метаболические процессы) и даже приводить их к гибели.
Температура является одним из наиболее мощных факторов, воздействующих на микроорганизмы. И хотя в целом развитие микроорганизмов происходит в очень широком диапазоне температур, для каждого конкретного вида существуют определенные температурные границы, в которых происходит их жизнедеятельность. Эта температурная зависимость характеризуется тремя точками:
– минимальной температурой развития (t minimum). Это такая температура, при незначительном снижении которой скорость роста стремится к нулю (V роста → 0);
– оптимальной температурой развития (t optimum). Это такая температура, при которой скорость роста является максимальной (V роста = mах);
– максимальной температурой развития (t maхimum). Это такая температура, при незначительном увеличении которой скорость роста стремится к нулю (V роста → 0).
В зависимости от отношения к той или иной температуре все микроорганизмы делятся на три основные группы: психрофилы, мезофилы и термофилы.
Психрофилы (греческое «психрос» – холод, «филео» – люблю) развиваются при низких температурах. Минимальной температурой развития у них является температура замерзания среды (около – 2 °С), оптимальная – 15…20 °С, а максимальная – 30…35 °С. К ним относятся обитатели холодных источников северных морей и океанов. Их часто обнаруживают на поверхности рыб. Многие из них, относящиеся к родам Рseudomonas, Аchromobacter, способны быстро вызывать микробиальную порчу рыбы, хранящейся при температуре 0 °С. К психрофилам относится большинство светящихся бактерий рода Photobacterium. Их развитие в морской воде вызывает ее свечение.
Мезофилы («мезос» – средний) – наиболее распространенная группа микроорганизмов, развивающихся в температурных пределах от 5–10 до 40–50 °С. Температурный оптимум для них составляет 25–30 °С. К этой группе относятся многие гнилостные бактерии, вызывающие порчу пищевых продуктов при положительных температурах, а также все патогенные и токсичные формы бактерий. Вместе с тем большинство промышленных процессов (получение органических кислот, ферментов и т. д.) осуществляется с помощью мезофилов.
Термофилы («термос» – теплый) развиваются в температурных пределах от 30–35 до + 80 и даже до + 90 °С с оптимумом 50–60 °С. Они присутствуют в почве, навозе, иле. Среди них есть как споровые, так и неспоровые бактерии. Наибольшее количество термофилов наблюдается в местах, постоянно испытывающих действие высоких температур (например, в горячих источниках).
Термофилия широко распространена среди анаэробов. В большинстве это споровые формы (например, представители рода Clostridium), причем споры у них отличаются особой термоустойчивостью. Поэтому они могут переносить стерилизацию и вызывать плоско-кислую порчу консервов.
Отрицательное воздействие на микроорганизмы оказывают как низкие, так и высокие температуры, но механизм их действия различен. Низкие температуры оказывают в основном бактериостатическое действие вследствие замедления протекания биохимических процессов (замедления метаболизма).
Гибель микроорганизмов (бактерицидное действие) наблюдается в случае чисто механического разрыва клеток образующимися в них кристаллами льда. Чем меньше образующиеся кристаллы льда и чем равномернее они распределены в клетке, тем меньше гибель микроорганизмов. И наоборот, чем крупнее кристаллы, тем больше клеток погибнет. Поэтому наиболее губительны для микроорганизмов температуры, которые соответствуют криоскопической точке цитоплазмы (от – 2 до – 5,6 °С).
Чем дальше температура отстоит от криоскопического значения, тем меньше гибель микроорганизмов.
Наиболее губительны для микроорганизмов высокие температуры. Повышение температуры приводит к ускорению биохимических реакций, но скорость реакций в клетке изменяется непропорционально, что приводит к дисбалансу и нарушению протекания метаболических процессов.
Высокие температуры (70–80 °С и выше) оказывают бактерицидное действие. Под их воздействием происходит денатурация белка, приводящая к нарушению проницаемости клеточных стенок, потере активности ферментов, изменению структуры цитоплазмы и, как следствие всего этого, гибели клетки.
Разные группы микроорганизмов проявляют разную чувствительность к действию высоких и низких температур. Наиболее чувствительны к действию низких температур термофилы и мезофилы, а к действию высоких – психрофилы и мезофилы. Наибольшей устойчивостью к действию высоких температур обладают споры. Воздействие высоких температур широко используется для подавления развития микроорганизмов.
Реакция среды рН определяется концентрацией ионов водорода. Хотя в целом микроорганизмы развиваются в очень широком диапазоне рН, каждой физиологической группе и даже отдельным видам соответствуют определенные значения рН (оптимальная зона рН), в пределах которых происходит их развитие. Плесневые грибы, дрожжи и бактерии рода Acetobacter лучше всего развиваются в кислой среде при рН = 3–5. Такие микроорганизмы называются ацидофильными.
Для большинства бактерий наиболее благоприятна нейтральная или слабощелочная среда с оптимумом рН 7,0–7,3. Изменение рН в кислую сторону губительно отражается на гнилостных бактериях. Наоборот, уксуснокислые бактерии к кислой среде устойчивы.
Особенно чувствительны к изменению реакции среды азотфиксирующие бактерии, в частности азотобактер. Он лучше всего развивается при рН 7,4–7,6, поэтому в кислых почвах его практически нет. Клубеньковые бактерии тоже лучше развиваются при слабощелочной реакции среды, хотя зона рН, при которой они могут развиваться, значительно шире, чем у азотобактера.
Влияние рН на развитие микроорганизмов основано на том, что реакция среды влияет на активность ферментов, так как каждый фермент проявляет свою активность только при определенных значениях рН. От концентрации ионов водорода зависит также поступление питательных веществ внутрь клетки и физическое состояние белков. Так, денатурация и выпадение большинства белков в осадок под действием высоких температур наиболее быстро и полно происходит в слабокислой среде. Увеличение кислотности среды наряду с температурой
широко используется для подавления развития микроорганизмов при консервировании пищевых продуктов.
Ход работы:
Занятие 1
1. Провести посев бактерий на питательные среды с различным значением рН.
Посев проводят в четыре пробирки на МПА (агар) с различным значением рН: в одной из них рН равно 3, во второй – 5, в третьей – 7 и в четвертой – 9. Перед началом посева каждую пробирку подписывают: указывают значение рН и ставят свой номер.
Для посева используют бактерии или из чистой бульонной культуры, или из плотной питательной среды. Посев производят бактериальной петлей или бактериальной иглой с соблюдением правил асептики. При посеве на плотную среду пользуются иглой, а на жидкую – петлей.
Петлю или иглу стерилизуют перед каждым посевом в пламени сухого горючего (фламбирование). После посева пробирки с засеянными средами помещают в штатив и ставят в термостат.
Термостатирование проводят в течение 24–48 ч при температуре 37 °С. После этого выращенные культуры микроорганизмов переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия.
2. Провести посев бактерий на питательные среды с различной концентрацией хлорида натрия.
Посев проводят в четыре пробирки напитательную среду с различной концентрацией хлорида натрия: 5, 10, 20% и без него (контрольный посев). Все пробирки предварительно подписывают и нумеруют. Посевы проводят бактериальной петлей, которую каждый раз стерилизуют в пламени спиртовки.
Пробирки с засеянными средами помещают в штатив и ставят в термостат. Посевы термостатируют в течение 24 ч при температуре 37 °С. После этого выращенные культуры переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия.
3. Провести посев бактерий на косой агар после воздействия на них высокой температуры.
Сначала готовят взвеси из культур бактерий, образующих и не образующих споры. Для этого берут две пробирки со стерильным изотоническим раствором. В одну вносят культуру сенной палочки (образует споры), а во вторую – молочнокислого стрептококка (не образует споры). Обе пробирки помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. После кипячения пробирки охлаждают и из каждой делают посев при помощи петли на косой агар. Перед каждым посевом петлю стерилизуют.
Пробирки с посевами подписывают, указав культуру, которая в них посеяна, и свой номер, помещают в штатив и ставят в термостат. Посевы термостатируют 24 ч при температуре 37 °С.
После этого выращенные культуры переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия.
4. Провести выращивание плесневых грибов при различных температурах.
Посеять споры плесневого гриба в три чашки Петри на сусло-агар (СА) или среду Сабуро с агаром. Предварительно готовят водяную суспензию спор. Для этого берут культуру плесневого гриба со зрелыми органами размножения (конидиями или спорангиями) и проводят по ним бактериальной петлей, предварительно смоченной в воде (чтобы споры лучше к ней прилипали). Затем вносят петлю в стаканчик или пробирку с водой (перенося туда споры) и тщательно перемешивают.
Переносить споры в пробирку можно несколько раз.
После этого стерильной бактериальной петлей берут каплю водяной суспензии спор плесневого гриба и осторожно наносят ее на СА, прикасаясь ребром петли в центр каждой чашки.
При повторных посевах петлю можно не стерилизовать. Все чашки необходимо подписать, указав на каждой из них температуру выращивания, и поставить свой номер. Все надписи делаются только на дне чашек.
Засеянные чашки переворачивают вверх дном и ставят посевы на выращивание. Выращивание микроорганизмов при температурах 5 °С проводят в холодильнике, а при температуре 25 °С – в комнатных условиях, недалеко от батарей центрального отопления (при этом чашки надо накрыть темным материалом, чтобы на них не попадал свет), при 40 °С – в термостате. Через 48–72 ч все чашки переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия.
4.5. Провести посев плесневых грибов или дрожжей на питательные среды с различной концентрацией глюкозы.
Посев проводят в четыре пробирки на пивное сусло или среду Сабуро с 20, 40 и 60%-ой концентрацией глюкозы и без нее (контрольный опыт). Все пробирки предварительно подписывают, указав концентрацию глюкозы и поставив свой номер.
Для посева используют суспензию спор плесневого гриба, приготовленную для предыдущего опыта. Кроме этого, готовят суспензию дрожжей. Для этого небольшое количество сухих дрожжей помещают в стаканчик или пробирку с водой и тщательно перемешивают. Посевы проводят стерильной бактериальной петлей или микропипеткой.
Пробирки с засеянными средами ставят в штатив и помещают в термостат, где их термостатируют в течение 48 ч при температуре 25 °С. В случае необходимости можно на это же время оставить пробирки на столике вблизи батареи центрального отопления. При этом предварительно они должны быть тщательно закрыты плотным темным материалом, не пропускающим свет. Через двое суток выращенные культуры переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия.
Занятие 2
Выполненные на предыдущем занятии посевы достают из холодильника и проводят их анализ.
1. Провести оценку роста бактерий на средах с различными значениями рН.
Интенсивность роста бактерий на средах с различными значениями рН определяется по степени мутности среды. Перед этим содержимое каждой пробирки, на которой был проведен посев на предыдущем занятии, тщательно перемешивают (вращая пробирки между ладонями) и затем сравнивают друг с другом.
2.Провести оценку роста бактерий на средах с различной концентрацией NaCl и без нее.
Интенсивность роста бактерий, как и в предыдущем опыте, определяется по степени мутности среды. Для ее проведения содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают и сравнивают его с содержимым других пробирок, определяя степень мутности, которая оценивается визуально и обозначается следующим образом: отсутствие роста (–); слабый рост (+); умеренный рост (++); обильный рост (+++).
3.Провести оценку роста бактерий после воздействие на них высокой температуры.
Действие высоких температур на спорообразующие и неспорообразующие бактерии определяют по характеру роста микроорганизмов на косом агаре (сплошной, в виде отдельных колоний или обильный, слабый, умеренный, отсутствие роста).
4. Приготовить мазки, окрасить их по Граму и промикроскопировать.
Для распознавания изучаемых бактерий (микрококки, сарцины, бациллы или неспороносные палочки) из двух пробирок с рН 7 и нулевой концентрацией соли готовят мазки, высушивают и фиксируют их, а затем окрашивают по Граму и микроскопируют с увеличением объектива 90х или 100х. Увиденное под микроскопом зарисовывают в тетрадь и формулируют выводы.
5. Провести оценку роста плесневого гриба, растущего при разных температурах.
Показателями влияния температуры на рост плесневых грибов служат величина колоний и интенсивность их спороношения. Для определения этих показателей чашки Петри, на которых росли грибы, переворачивают и со стороны дна чашки измеряют при помощи линейки диаметр выросших при разной температуре колоний. Полученные результаты записывают в табл. 4 и делают выводы.
Для оценки интенсивности спороношения, как и в предыдущих опытах, пользуются следующими условными обозначениями: спороношение отсутствует (–); спороношение слабое (+); спороношение умеренное (++); спороношение сильное, или обильное (+++). Полученные данные заносят в табл. 4 и делают выводы о влиянии различных температур на рост и спороношение плесневого гриба.
5. Определить родовое название гриба
Для определения родового названия выросшего гриба готовят препарат типа «раздавленная капля» и микроскопируют его. Препарат готовят обычным способом.
Внимание! Для того чтобы органы размножения грибов не нарушились и споры не осыпались, кусочек мицелия берут очень аккуратно на границе участка с заметным спороношением.
Приготовленный препарат микроскопируют на увеличение объектива 10х. При микроскопировании надо найти и зарисовать органы размножения гриба и по ключу определить его родовое название.
6. Провести оценку роста плесневого гриба и дрожжей, растущих при различной концентрации глюкозы.
Влияние концентрации глюкозы в среде на рост плесневого гриба определяют по интенсивности развития мицелия и спорообразования. Для этого просматривают пробирки с посевами, сделанными на предыдущем занятии, и сравнивают их друг с другом. При сравнении полученных результатов пользуются условными обозначениями: отсутствие роста или спорообразования (–); слабый рост или спорообразование (+); умеренный рост или спорообразование (++); обильный рост или спорообразование (+++). Полученные данные заносят в таблицу и формулируют выводы.
Интенсивность развития дрожжей на средах с различной концентрацией глюкозы определяется по степени мутности сусла. Перед определением содержимое каждой пробирки, на котором был проведен посев на предыдущем занятии, тщательно перемешивают (вращая пробирку между ладонями) и затем сравнивают ее с содержимым других пробирок. Интенсивность развития дрожжей по мутности среды характеризуют, используя указанные выше условные обозначения. Полученные данные заносят в таблицу и делают выводы.