Цель работы. Освоить методику приготовления нервно-мышечного препарата лягушки
Лягушка – традиционный объект физиологических исследований. Международные правила защиты животных предусматривают эксперименты на них с учебной и исследовательской целью, категорически запрещая при этом всякую вивисекцию, т. е. операции на живых, не наркотизированных или на необездвиженных и необезболенных объектах. Все опыты на лягушках проводят после наркотизации (эфир) и последующего разрушения спинного мозга, в котором проходят проводящие болевые пути.
Классическим объектом исследования является нервно-мышечный препарат, на котором великие физиологи — Н. Маттеучи, Л. Гальвани, И.М. Сеченов, Н.И. Введенский и др. исследовали основные закономерности функционирования живого организма.
Оборудование: препаровальный набор, раствор Рингера для холоднокровны животных, марля, эфир. Объект исследования - лягушка.
ХОД РАБОТЫ
1. Обездвижьте лягушку. Для этого оберните марлей наркотизированную эфиром лягушку так, чтобы лапки ее были прижаты к туловищу, а голова оставалась свободной. 
Рис. 1. Обездвиживание лягушки (а, б, в).
Большим пальцем наклоните вперед голову лягушки и найдите углубление, соответствующее атланто-окципитальному отверстию, по центру кзади от затылочной кости. Сразу за глазными буграми вертикально введите в субокципитальное отверстие конец препаровальной иглы на глубину 1—2 мм, поверните ее параллельно центральному каналу, введите в него и продвиньте до крестцово-копчикового соединения, круговыми движениями разрушая спинной мозг. Критерием разрушения является полная релаксация (расслабление) всех групп мышц лягушки и отсутствие защитных двигательных рефлексов на пощипывание кожи и потягивание за лапку. Извлеките иглу из центрального канала и, повернув ее на 180 °, разрушьте головной мозг.
2. Приготовьте нервно-мышечный препарат. Возьмите лягушку за задние лапки, поверните вниз брюшком и, отступив на 1,5 см выше от копчика, перережьте позвоночный столб с окружающими тканями. В руке должны остаться задние лапки с тазовой костью и небольшим отделом позвоночного столба. Захватив край кожи пинцетом, снимите ее с лапок. Подведите браншу ножниц под пояснично-крестцовое сочленение и отделите одну лапку ниже так, чтобы сочленение осталось соединенным с фрагментом позвоночного столба. Расположите препарат задней поверхностью вверх. Раздвинув стеклянным крючком двуглавую и полуперепончатую мышцы, найдите на бедре седалищный нерв. Приподнимите его и на всем протяжении осторожно отделите от окружающих тканей. Бедренную кость и мышцы рассеките в двух местах: ниже тазобедренного и выше коленного суставов. Затем выделите икроножную мышцу: отпрепарируйте ее, отрежьте сухожилие от пяточной кости, а ниже коленного сустава перережьте кости и все мышцы голени. Пяточное сухожилие перевяжите ниткой. В результате получится нервно-мышечный препарат, который является универсальным для исследования функций скелетных мышц и нервов.
Следует помнить, что при небрежном приготовлении препарата (прикосновение к нерву руками или металлическими предметами, натяжение, подсыхание, механическое повреждение) препарат быстро теряет возбудимость. Поэтому во время проведения опыта необходимо часто увлажнять нерв и мышцу раствором Рингера.
Л абораторная работа № 2. Одиночное и тетаническое сокращение
Цель работы. Определение порога раздражения мышцы. Получение кривой одиночного сокращения мышцы, а также зубчатого и гладкого тетануса
Оборудование: кимограф, вертикальный миограф, универсальный штатив, электронный стимулятор, набор препаровальных инструментов, раствор Рингера для холоднокровных животных. Объект исследования — нервно-мышечный препарат (икроножная мышца — седалищный нерв лягушки).
ХОД РАБОТЫ
1. Соберите установку для работы с нервно-мышечным препаратом лягушки (рис.1). 
Рис. 1. Установка для работы с нервно-мышечным препаратом лягушки.
1— стимулятор УЭС-1; 2 — универсальный штатив; 3 — вертикальный миограф; 4 — мышца лягушки, фиксированная за бедренную кость; 5 — миографический рычажок; 6 — кимограф; 7 — барабан кимографа; 8 — столик-ванночка для размещения нерва с сегментом спинного мозга.
2. Раздражение мышцы прямым и непрямым способами. Приготовленный нервно-мышечный препарат зафиксируйте в вертикальном положении за бедренную кость в штативе. К нижнему концу мышцы прикрепить за длинное плечо рычажок миографа – мышцу расположить над рычагом.
Седалищный нерв расположите горизонтально так, чтобы он контактировал с раздражающими электродами, наложите на него тонкий слой ваты, обильно смоченный раствором Рингера. Включите стимулятор. Ручку плавной регулировки силы тока установите в положение "О", а переключатель частоты — в положение "1". Ключ поставьте в положение "Нерв" и, медленно вращая ручку регулировки силы тока, найдите его минимальную силу (порог раздражения), вызывающую минимальное сокращение мышцы. Подведите к ленте кимографа рычажок с писчиком, заполненный чернилами, и запишите мышечное сокращение при непрямом раздражении мышцы. Затем поставьте ключ в положение "Мышца" и аналогичным способом определите порог возбуждения мышцы при ее прямом раздражении. Запись производите на ленте остановленного кимографа, поворачивая барабан рукой после каждой стимуляции.
3. Получение записи одиночного сокращения мышцы. Найти среднюю силу индукционного тока (частота раздражения не должна превышать 1 Гц, длительность 0,5 мс), вызывающего сокращение мышцы (раздражать непосредственно мышцу редкими импульсами – 3 раза в с). Привести писчик в соприкосновение с барабаном кимографа, пустить барабан в ход и быстро замкнув и разомкнув ключ, записать 3-5 сокращений мышцы. Обратить внимание, какой вид имеет кривая одиночного сокращения.
4. Получение зубчатого и гладкого тетануса. Сокращения мышцы записывать на вращающемся барабане. Подряд несколько раз раздражать мышцу, быстро замыкая и размыкая ключ рукой, постепенно наращивая частоту раздражения – 5, 10, 15, 20 Гц (увеличить число раздражающих импульсов до 13-15 в с), чтобы каждое последующее раздражение совпадало с моментом, когда мышца только начала расслабляться от предыдущего раздражения (для этого раздражать ее, когда писчик только-только начнет опускаться вниз). Затем еще больше увеличить частоту раздражений мышцы (увеличить число раздражающих импульсов до 20-30 в с). Для этого или еще чаще замыкать и размыкать ключ рукой, или переключить стимулятор на генерирование прерывистой подачи тока с помощью прерывателя. Раздражения должны поступать в мышцу, когда она еще не начала расслабляться от предыдущего раздражения (когда писчик еще стоит наверху и не начал опускаться. Посмотреть какой вид имеют кривые.
5. Получение оптимума и пессимума частоты раздражения. Мышцу закрепите в миографе, нерв положите на раздражающие электроды. Электроды соедините со стимулятором (ток сверхпороговый, длительность импульсов — 0,5 мс).
До проведения опыта подберите минимальную частоту раздражения нерва, при которой мышца будет сокращаться по типу гладкого тетануса. Подведите писчик миографа к барабану кимографа и запишите сокращения мышцы при раздражениях нерва ритмическим током частотой 30 Гц, 40 Гц. Обратите внимание на то, что при увеличении частоты раздражения нерва амплитуда гладкого тетануса увеличивается. При частоте раздражения порядка 50 Гц амплитуда тетануса становится наибольшей; это — оптимум.
Увеличьте частоту раздражения нерва до 140 Гц. При этом наблюдается сокращение мышцы на начало раздражения, за которым следует ее расслабление при продолжающемся раздражении нерва; это — пессимум.
Можно доказать, что состояние пессимума не является следствием утомления мышцы (Н.Е. Введенский). Попробуйте во время пессимального расслабления мышцы (частота раздражения нерва 140 Гц) быстро переключить стимулятор на более низкую частоту (50 Гц). После переключения мышца немедленно из состояния пессимума перейдет к оптимуму или к одному из видов тетануса — зубчатому или гладкому в зависимости от частоты раздражения в данный момент.
Оформление протокола.
1. Зарисовать кривую возбудимости мышцы прямым и непрямым способами.
Рис. 12. Определение возбудимости нерва и мышцы.
Раздражение мышцы: а — непрямое (через нерв); б — прямое (на мышцу). Стрелками обозначены моменты нанесения раздражения; цифрами — показания шкалы стимулятора, мВ.
2. Зарисовать кривую одиночного сокращения мышцы, а также кривые зубчатого и гладкого тетануса
Рис. 13. Зависимость характера мышечных сокращений икроножной мышцы лягушки от частоты раздражения.
1 — одиночные сокращения;
2 — зубчатый тетанус;
3 — гладкий тетанус.
3. Зарисовать схему гладкого тетануса икроножной мышцы, записанного при разной частоте стимуляции нерва. Сделайте вывод о зависимости амплитуды гладкого тетануса от частоты стимуляции нерва. Укажите, при какой частоте возникает оптимум и при какой — пессимум.
|
Рис. 14. Зубчатый и гладкий тетанус, оптимум и пессимум, возникающие в ответ на различную частоту раздражения:
1 — оптимум; 2 — пессимум; 3 — зубчатый тетанус; 4 - одиночные сокращения на возрастающие по силе раздражения
4. Дайте оценку возбудимости нерва и мышцы, сравнив пороги их возбуждения.
5. Сделайте соответствующие выводы:
1-----------------------------------------------------------------------------------------------
2----------------------------------------------------------------------------------------------
3----------------------------------------------------------------------------------------------
Контрольные вопросы для самостоятельной подготовки
1. Прямое и непрямое раздражение мышц.
2. Раздражители и их классификация.
3. Порог раздражения.
4. Одиночное сокращение мышцы.
5. Зубчатый и гладкий тетанус.
Лабораторная работа 3.