Фармакологические и медико-биологические исследования
Пигмент «меланин» растительного, животного и синтетического происхождения обладает свойствами стабильных свободных радикалов, с долгоживущими парамагнитными центрами - это свойство характерно веществам называемых «меланин». Парамагнитное состояние определяется d-уровнем распределения электронов в молекуле. Этот уровень незаполненный и легко заполняется свободными реакционно-активными соединениями как радикалы. В живой природе все другие органические вещества обладают диамагнитными свойствами. Сравнительный анализ сигналов ЭПР, полученных от растительного меланина и животного меланина показал, что имеется положительная корреляция между количеством пигмента и содержанием свободных радикалов.
Меланины пигменты растительного и животного происхождения, имеют различное химическое строение окисленных фенолов, которое было установлено по продуктам распада под влиянием окислителей. Продукты распада меланинов, полученных из различных биологических материалов, отличались между собой по качеству и количеству разрушенных веществ. Животные меланины имеют индольные типы строения, растительные меланины обладают пирокатехиновой природой строения. Природные клеточные пигменты, относящиеся к группе низкомолекулярных фенольных соединений, образующих сложную полимерную структуру полифенолкарбонового комплекса. Химическое строение природных меланинов до сих пор окончательно не установлено вследствие их чрезвычайно сложной полимерной структуры. В настоящее время, известна большая группа пигментов. Меняющиеся по окраске пигменты от желтого до светло-коричневого, по биологически и химически неродственных черным или коричневым пигментам. Азотосодержащие черные пигменты производные индола. Темные пигменты, темно-коричневые, продукты окисления без азотистых фенолов (например, пирокатехин). Меланогенезы у растений были изучены на цветках и почерневших плодах бобов различных видов и кожуры банан содержащих бета-(3,4-деоксифенил)-L-аланин и родственные соединения (20). Синтетические меланины были приготовлены путем окисления L-тирозина и пирокатехина при участии фенолазы из картофеля. Фармакологический эффект водорастворимого растительного меланина исследован интенсивно. Обнаружено, что благодаря стабильному свободно радикальному состоянию и способности обратимо окисляться и восстанавливаться, меланины обеспечивают защиту организма от экстремальных условий.
Водорастворимые растительные меланины исследовали на процессы язвообразование у животных. Исследованию подвергались лабораторные животные (крысы 200-230 г.) на которых воздействовали физическими факторами провоцируемые возникновение язв в желудке. Животным первой группе (n=20) препарат вводили в дозах 5 мг/кг, 10мг/кг,15мг/кг, 20мг/кг, 25мг/кг однократно внутрибрюшинно и внутривенно. Контрольной группе (n=10) вводили изотонический раствор хлорида натрия. За животными следили 36 часов. После окончания опыта животных декапитировали и исследовали желудок. Опыт показал, что меланин в дозе 10 мг/кг способствовал активному торможению язвообразованию в желудке. У контрольных животных процесс язвообразование был активно выражен с многочисленными язвами различных диаметров и местом расположения в желудке. У животных получавших меланин вес под действием стресса (физические факторы) не уменьшался.
Во время стресса особой чувствительностью к переокислению липидов обладают ткани миокарда, скелетных мышц, и нервных волокон. Воздействие химических факторов, возникших в результате стресса, инициируют окисление липидов мембран, что ведет к нарушению нормальной структуры саркоплазматического ретикулума и снижению эффективности работы его функциональных систем. Достоверное снижение сахара в крови. Нормализация содержания гликогена в нейтрофилах. Предотвращение резкого падения содержания липидов в коре надпочечников стрессированных крыс при введении меланина указывает на участие «стресс-протекции». У животных употребляющих водорастворимый растительный меланин, фактов нарушений не наблюдалось. Меланины наряду с другими еще не выясненными функциями, играют в организме роль клеточных фото- и радиопротекторов, эндогенных регуляторов окислительно-восстановительных потенциалов, гормонов гомеостатических реакций. Учитывая эти факты и своеобразные хемопротекторы свойства пигментов, меланины могут быть использованы в фармакологии. Опыты проводились на мышах линии СВА. Животным первой группы (n=15) препарат вводили в виде 3% водного раствора водорастворимого растительного меланина однократно внунрибрюшинно и перорально в дозах 100, 250, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2500, 3000 мг/кг. Контрольной группе вводили изотонический раствор хлорида натрия. За животными следили трое суток, гибели не наблюдалось. Второй группе (n=20) препарат вводили в дозе 10 мг/кг ежедневно раз в сутки на протяжении 15 дней. Контрольным животным вводили дистиллированную воду. Во время опытов все животные были на стандартном водно-пищевом рационе. После окончания опыта животных декапитировали и исследовали кусочки легких, печени, почек, селезенки и желудка. Изменений в этих органах не выявлено. Острая токсичность препарата очень низкая (ЛД50>2500 мг/кг), что весьма важно для его возможного применения в фармакологии. Применение меланина на протяжении 15 дней в дозах 10 мг/кг также не вызывает патологических изменений внутренних органов животных.
Свойства меланина в противоопухолевой активности. Если для клетки важно само физико-химическое свойство ее биохимических компонентов, то добавлением меланина (нетоксичного химического препарата) можно достичь направленного изменения этого свойства, так как и течение процесса, зависящего от его изменения. Так как клетка богата донорами, но бедна акцепторами, ее физическое состояние и активность вряд ли заметно изменяются при введении в нее небольшого количества дополнительных доноров. С акцепторами дело обстоит иначе – они, вероятно, обладают регуляторной активностью. В результате меланиногенеза происходит обмен донорной группы (фенольного гидроксила) 5,6 ДОИ - меланина на акцепторную СО - группы, акцепторные свойства которых усиливаются благодаря расширению системы сопряжения. Поскольку атом кислорода СО – группы имеет не поделенную пару электронов, донорные свойства карбонила проявляются особенно заметно в присутствии каталитической группы CS, которая забирает один из неподеленных электронов кислорода и превращается в группу CSH, т. е. действует как катализатор – переносчик электронов кислорода. Последнее свойство представляет особый интерес, поскольку в благоприятных условиях меланины могут вступать в донорно-акцепторное взаимодействие, отдавая целый электрон и играя, таким образом, роль мощных доноров в процессе переноса заряда. В опытах, для проверки меланина на канцерогенную активность, у животных не было обнаружено никаких изменений. Исследование водорастворимого меланина показало высокую эффективность противоопухолевого вещества. Получение растворимого в воде меланина является важным технологическим новшеством. Не растворимый в воде пигмент меланин выполняет функцию адсорбента. Эксперименты по очистке водонерастворимым меланином спирта показало очистку от альдегидов на 8%, кетонов 5% сивушных масел на 19%. Тяжелые металлы на 1 гр. меланина до 80% меди, 60% кадмия, 50% ртути и других вредных примесей, попадающих в пищевые продукты. Водонерастворимый меланин пигмент не способен проникать в межклеточное пространство и выполнять сложные биохимические и физические функции. В организме животных меланин синтезируется клетками меланоцитами, в растворимой форме и легко транспортируется в межклеточном пространстве, снабжая 30 рядом расположенных клеток. Небольшое количество растворенного меланина за счет взаимодействия воды и меланина улучшают структуру воды клеток и тканевой жидкости. Вода+меланин это единая самоорганизованная живая система, имеющая наилучшую проникающую способность через клеточную мембрану. Известно, что вода состоит из кластеров, 1 микрон содержит 440 000 кластеров. Кластеры образуют структуру воды. Структура воды обладает само подобием или фрактальностью. Структура воды важнее химического состояния воды. Установлено американскими исследователями Мичиганского университета, что структурированная вода представлена в здоровых клетках, в больных клетках, не зависимо от патологии, насыщена не структурированной водой. Водорастворимый растительный меланин хорошо реагирует с водой, входит в структуру воды и этим улучшает структуру воды. Получение растворимого в воде меланина позволяет легко перемещаться, так как биологические системы на 80% состоят из воды. Водорастворимая форма меланина была апробирована на культуре клеток рака человека в частности, линий клеток рака легкого (85%-ная гибель) и рака молочной железы (две линии свыше 90%), клеточной линии карциномы толстой кишки (80% -ный результат).
При лечении больных-добровольцев:
|
|
|
|
|
|
Пример 1. Больной В. Рак легкого, прием внутрь перорально 40-100 мг суточная доза, выздоровление через 2 года.
Пример 2. Больной И. (меланома) IV стадия, прием внутрь 60-100 мг суточная доза и прикладывание на лимфоузлы, выздоровление через 1 год 7 мес. Высокая работоспособность.
Пример 3. Больной А. Рак прямой кишки суточная доза 60-100мг выздоровление через полтора года.
Пример 4. Больной С. рак полости рта, суточная доза внутрь 90-400 мг. Через 2 недели опадение опухоли, возобновление возможности говорить, самостоятельно принимать пищу, улучшение формулы крови.
Употребление 1% -2% раствора продемонстрировало высокое противоопухолевое свойство. Изучение влияния различных концентраций водорастворимого растительного меланина на фагоцитарную активность лейкоцитов. Исследованию подлежали лейкоциты человека, на которые воздействовали меланином в концентрациях 0,1%, 0,01%, 0,001%. Фагоцитарную активность лейкоцитов изучали по количеству активных лейкоцитов (на 100 клеток). Поглотительной способности лейкоцитов в отношении стафилококка (S.aureus №109) и переваривающим свойствам. Меланин в концентрации 0,1% способствовал увеличению удельного веса активных клеток и усиливал поглотительную функцию лейкоцитов почти в 2 раза. Уменьшение концентрации меланина в 10-100 раз (0,01%,,001%) в системе биостимулятор-лейкоциты привело к тому, что у макрофагоцитов активизировалась переваривающая функция и сохранение остальных характеристик на уровне контрольных показателей. Водорастворимый меланин в виде 1% раствора «меланиновый экстракт» положительно действует на иммунную систему человека с синдромом иммунодефицита с глубоким угнетением клеточного и гуморального иммунитета.
Пример 5. Больному В.П. с синдромом иммунодефицита назначили водорастворимый меланин 1% раствор «меланиновый экстракт» спустя три месяца наблюдалась стабилизация клеточного и гуморального иммунитета, что наблюдалось при исследовании иммунограммы крови.
Установлено экспериментальным путем, что водорастворимый меланин блокирует вирус ВИЧ трех видов, не позволяет вирусу проникать в клетки с рецептором CD4.Меланин блокирует белки gp120 и gp 160 вируса ВИЧ не позволяя проникнуть в клетку и начать размножаться.
Влияние водорастворимого растительного меланина на нервную систему изучали на беспородних крысах-самцах массой 220-280 г по комплексу поведенческих, морфологических, ультраструктурных, гисто - и биохимических показателей на моделях острого и длительного стрессовых воздействий. Длительное стресс-воздействие моделировалось семи суточным стрессом животных деривацией быстрого сна по Мендельсону (8). Для оценки эмоционально-поведенческой реактивности использовали тест „открытого поля”, в котором регистрировали вертикальную, горизонтальную и исследуемые активности. Способность решения эксполяционной задачи, необходимой для избавления от стресса – ситуации, определяли модифицированным тестом Хандерсона (9). Иммобилизационный стресс создавали фиксацией крыс в области шейного и поясничного отделов в специальных станках в течение 4 часов. Водорастворимый растительный меланин в виде водного раствора, вводили внутри брюшинно в дозе 10 мг/кг за 20 мин до начала «стресс» воздействия при кратковременных и два раза в сутки при длительном стрессе. Опыт показал, что однократное введение водорастворимого растительного меланина вызывает слабый активирующий эффект у не эмоциональных животных и угнетает эмоциональных. Длительное введение водорастворимого растительного меланина препятствует развитию эмоциональных чрезмерных проявлений, что выражается в нормализации двигательной и восстановлении исследуемой активности. Использования водорастворимого растительного меланина в качестве активного вещества в 1% водно спиртовой растворе продемонстрировало на примере:
Пример 6. Больной К. под влиянием стресса перестал самостоятельно ходить, показатели анализов мочи стали плохими, состояние здоровья ухудшалось. Употребление 1% раствора водорастворимого растительного меланина в дозе 40-60 мг в сутки в течение трех месяцев восстановило здоровье и позволило вернуться в нормальный рабочий ритм. Положительный эффект водорастворимый растительный меланин показал при лечении инсульта: Пример 7. Больной М. после перенесшего инсульта начал терять речь. При употреблении 1% раствора в дозе 50 мг в сутки водорастворимого растительного меланина через 1(один) месяц у больного начала восстанавливаться речь. Через полгода, восстановил здоровье и больной приступил, к активной трудовой деятельности.
При исследовании крыс, при стресс-воздействию достоверно снижался сахар в крови, нормализовалось содержание гликогена в нейтрофилах. Предотвращение резкого падения содержания липидов в коре надпочечников стрессированых крыс при введении внутривенно 10 мг /кг водорастворимого растительного меланина. Это указывало на четко выраженную реакцию участия водорастворимого меланина в защите от «стресса» фактора. Учитывая такой факт, было предложено больному добровольцу с приобретенным сахарным диабетом цикл употребления 1% водно-спиртового раствора (действующее вещество водорастворимый растительный меланин) в течение трех месячного цикла.
Пример 8. Больной доброволец М. перед употреблением водорастворимого растительного меланина «меланиновый экстракт» имел следующие показатели крови РОЭ 28 (норма 2-4) гемоглобин 92 (норма 117) сахар 14 (норма 4,2-5,2). После употребления РОЭ 2, гемоглобин 115, сахар 5,3.
Пример 9. Больной В. имел проблемы на почве диабета, загноился палец. Была назначена ампутация. В качестве альтернативы врачом было предложено применение водорастворимого растительного меланина «меланинового экстракта» в качестве компресса на проблемный палец и употребление внутрь. В течение трех дней больной прикладывал компресс на палец, в результате палец зажил, покрылся молодой кожицей, стал здоровым. Употребляя внутрь «меланиновый экстракт» произошло уменьшение сахара в крови. Перед назначением на операцию сахар был 22, после трех недель употребления сахар-5.5.
Пример 10. Больной Р. возраст 1,5 года количество сахара в крови 14 единиц (норма 4,3-5,2) количество инсулина в крови 0,6 единиц (норма 2,1) врачи предложили колоть инсулин. Если в таком возрасте колоть инсулин вырабатывается в организме зависимость к инсулину и свой инсулин поджелудочная железа вырабатывать не будет. Поэтому, рекомендовали найти средство способное восстановить работу поджелудочной железы, таким средством стал водорастворимый растительный меланин «меланиновый экстракт». Через полгода употребления водорастворимого растительного меланина «меланиновый экстракт» сахар стал 5,1 единиц, количество инсулина 1,8 единиц при этом «УЗИ» показало увеличенную в два раза поджелудочную железу. Употребление еще полгода показало, сахар до еды 4,3 после еды 4,7. Количество инсулина в крови 2,1. Объём поджелудочной железы пришел в норму. Ребёнок выздоровел. Наблюдение в течение года не выявило рецидивов, все параметры находились в показателях нормы.
Способность водорастворимого растительного меланина препятствовать развитию невротических сдвигов и соматических патологических изменений может быть связано с нормализацией нейромедиаторных процессов, так и ингибированием реакций свободнорадикального окисления липидов клеточной мембраны. Антиоксидантная активность водорастворимого растительного меланина наблюдали в опыте. В контрольный раствор добавили 1 мл клетки крови человека и 0,5 мл Н2О2 3% перекись. Регистрировали продукты разрушения клеток крови методом спектрофотометрии. Показатель количества разрушенных клеток, был высоким. Добавление 0,2 мл 1% раствора водорастворимого растительного меланина в смесь состоящей из 1 мл клетки крови человека и 0,5 мл Н2О2 3% перекиси, процесс разрушения клеток крови останавливался в течение 20 секунд. Наличие у растворимого растительного меланина антистрессовых и антиоксидантных свойств позволило ожидать наличие противосудорожного действия. Одним из патогенетических звеньев в возникновении эпилептической активности является нарушение регуляции процесса, перекисного окисления липидов в нейрональных мембран мозга. Опыты проведены на белых беспородных крысах массой 170-210 г. Противоэпилептическое действие водорастворимого растительного меланина исследовали на моделях первично-генерализованной и очаговой элептической активности. Первично-генерализованнуюэлептическую активность вызывали внутрибрюшинным введением коразола в дозе 80 мг/кг. Электрокортикограмму регистрировали с помощью эпидурально наложенных электродов в области лобного и затылочного полюсов полушарий. Опыты начинали через 1,5-2 ч после прекращения наркоза (нембутал), примененного для проведения указанного оперативного вмешательства. Электроактограмму и электрокортикограмму регистрировали на энцефалографе ЭЭГ-4П-02, сразу после введения коразола одновременно проводя визуальное наблюдение. Интенсивность судорог оценивали в баллах: 0 баллов – отсутствие судорог, 1 балл – судорожные вздрагивания, 2 балла – конические судороги. 3 балла – выраженные конико-тонические судороги с падением животного набок и четкой тонической экстензией, 4 балла – конико-тонические судороги, приводящие к гибели животного. Определяли летальные периоды проявления первых судорожных проявлений и летальность животных.
Очаговую эпилептическую активность вызывали путем аппликации 1% раствора натриевой соли пенициллина на обнаженную поверхность сенсомоторной зоны коры одного из полушарий головного мозга. В зоне аппликации возникал детерминантный, а в симметричном гомотопическом участке другого полушария – «зеркальный» синхронизированный детерминантный очаг эпилептической активности. Электрокортикограмму регистрировали на 8-канальном полиграфе РМ-86М. Водорастворимый растительный меланин вводили внутрибрюшинно в виде 1% раствора в дистиллированной воде в дозах 10-100 мг/кг.
Водорастворимый растительный меланин при предварительном введении вызывал отчетливый защитный эффект при первично-генерализованыхкоразоловых судорогах, а его введение на фоне уже развившихсяконическо-тонических судорог значительно ослабляло их в большинстве случаев. Максимальный защитный эффект водорастворимого меланина отмечался в дозе 50 мг/кг. В отличие от жирорастворимых антиоксидантов, противосудорожное действие которых на модели фокальной эпилепсии проявлялось обычно не ранее чем через 18 часов после их внутрибрюшного введения. Водорастворимый растительный меланин мог эффективно подавлять эту эпилептическую активность уже через несколько минут (а иногда практически сразу) после его введения в организм.
Полученные результаты свидетельствуют о наличии у водорастворимого растительного меланина выраженного противосудорожного действия, которое по-видимому, определяется не только его антиокислительными свойствами. Полученные данные подтверждают факты использования меланина (различного происхождения) в качестве профилактики и лечения дегенеративных заболеваний нервной системы. В качестве примеров заболеваний нервной системы использовались болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, пигментознаяретинопатия и слабоумие. Полученные факты позволили нам рекомендовать больным добровольцам синдромом Паркинсона пройти курс лечения водорастворимым растительным меланином.
Пример 11. Больной Э. возраст 65 лет мужчина. Употребление 1% раствора действующего вещества водорастворимого растительного меланина, вода, соль натрий хлор 0,1г на 100 мл. В течение шести месяцев употребление в дозе 50 мг в сутки, полное выздоровление.
Пример 12. Больной М. возраст 63 лет женщина. Употребление 1% раствора действующего вещества водорастворимого растительного меланина, вода, соль натрий хлор 0.1 г на 100 мл. В течение четырех месяцев употребления в дозе 50 мг в сутки, полное выздоровление.
Изучение влияния водорастворимого растительного меланина на гормональный статус в организме. На биохимические показатели крови, а также на ультраструктуру гипоталамуса, щитовидной железы, надпочечников и печени белых крыс в условиях комбинированного действия тотального гамма-излучения и стресса. Опыты проводили на крысах вес 200-250 г, находящихся в стандартных условиях вивария. Животные были поделены на четыре равные группы.1 гр. - контрольные животные, 2. гр.- животные, получавшие действие гамма излучений и стресс воздействие, 3. гр.- животным в рацион кормления добавляли водорастворимый растительный меланин, 4 гр. – на фоне комбинированного влияния гамма излучения и стресса употребляли водорастворимый растительный меланин. Для общего одноразового излучения в дозе 2 гр. Была использована установка «ИГУР» с источником излучения 137 Cs (660 keB) одноразового облучения. Дополнительно животные второй и четвертой группы получали двухчасовойиммобилизационный стресс. Водорастворимый растительный меланин давали из расчета 1 мг меланина на 1 мл дистиллированной воды на каждое животное и начинали давать на 3 день до облучения и продолжали на протяжении всего эксперимента. Через месяц с момента облучения животных декапитировали. Установлено нормализирующее действие водорастворимого растительного меланина на уровне гормонов надпочечников и щитовидной железы. Выявлено, что водорастворимый растительный меланин имеет четко выраженное противострессовое действие, которое основано на антиоксидантных механизмах действия вещества. Употребление водорастворимого растительного меланина уменьшает дистрофически-деструктивные изменения в печени, гипоталамусе, щитовидной железе и надпочечниках, вызываемые комбинированным действием ионизирующего излучения и стресса. Учитывая такие свойства водорастворимого растительного меланина, было предложено:
Пример 13. Больному З. добровольцу с диагнозом тиреотоксикоз средней тяжести (ликвидатору 1986 г. Последствий Чернобыльской аварии) пройти цикл употребления водорастворимого растительного меланина. Больной употреблял 1% раствор действующее вещество водорастворимый растительный меланин, спирт, вода. В количестве 50 мг суточная доза в течение трех месяцев. Показатель: гормоны крови до употребления водорастворимого растительного меланина «меланиновый экстракт» TTG=0,00 mu/ml (норма 0,3-3,8), T-4св.= 44,89 pmol/l (норма 9,8-16,8). После употребления ТТG=0,17mu/m1(норма 0,17-4,04). T-4св = 14,81 pmo1/1 (норма 9,8-16,8).
После аварии 1986 г на Чернобыльской атомной электростанции, на загрязненной территории радионуклидами сложились условия, при которых населению приходится пребывать продолжительное время в радиационных полях низкой интенсивности. Поэтому проблема химиопрофилактики организма на основе современных представлений первичных механизмов радиобиологических эффектов является наиболее актуальной. Поиск новых способов (новых веществ) профилактики на основе применения перехватчиков супероксидов и гидроксильных радикалов которые взаимодействуют с ДНК молекулой. Исследования роли меланиновых пигментов, полученных у клеток разных классов растений и животных, показал, что они принимают участие в свободно-радикальных процессах. Было показано, что меланинам характерно радиопротекторное свойство. Обусловлено непосредственным взаимодействием меланина со свободными радикалами. Взаимодействия возникают при облучении биологических объектов. Исследование проводилось на 83 нелинейных крысах самцах вес 200-250 гр., пребывали на протяжении года и шести месяцев в г. Чернобыль и содержались на рационе пище, загрязненной радионуклидами, такими как 134Cs, 137Cs, 90Sr, 239Pu,241Pu 241Am, и другие. Меланиновый пигмент (не растворимая форма меланина) в дозе 250 мг/кг давали в пищу. Исследователи предполагали, что под действием пищеварительных соков часть вещества растворится. В растворимой форме попадет в организм животных. На протяжении месячного цикла восстановления и еще один месячный цикл (в течение 60 дней). Уровень гидроксильного радикала оценивали при помощи поглотителя, которым был диметилсульфоксид. При окислении диметилсульфоксид гидроксильными радикалами образуют метиловые радикалы, продукты которых с кислородом есть формальдегид. Формальдегид определяется методами спектрофотомерии и флуоресценции. Содержание гидроксильных радикалов в печени животных, которые на протяжении 1,5 года находились в зоне аварии Чернобыльской атомной электростанции, составил 0,050-0,180 относительных единиц. Меланин тормозит содержание гидроксильных радикалов к уровню 0,033-0,060 относительных единиц. Гидроксильные радикалы из-за своей высокой электрофильности и термохимической реакционности есть основным радикалом кислорода, который активно реагирует с ДНК, активирует её разрушение, и активирует канцерогенез.
Показательные исследования на клетках крови млекопитающих продемонстрировано на влиянии водорастворимого растительного меланина на гемолиз эритроцитов, вызванный фотоактивированымхлорпромазином, реактивом Фентона, а также на иммунный и осмотический гемолиз. Степень гемолиза измеряли на 1% суспензии омытых бараньих эритроцитах по поглощению надосадочной жидкости при 420 нм. Влияние водорастворимого растительного меланина на гемолиз оценивали в процентах, по отношению к поглощению в контроле (без добавления меланина в инкубационную среду).
1.Хлорпромазиновы гемолиз. К суспензии эритроцитов, содержащей 0,05 мг/мл хлорпромазина (минимальная концентрация, вызывающая полный лизис после 15-20 мин освещения солнечным светом), добавляли разные количества водорастворимого растительного меланина 0,01-0,2 мг/мл, смесь облучали 15-20 мин солнечным светом и через 24 часа измеряли поглощение супернатанта при 420 нм. Водорастворимый растительный меланин существенно ослабляет гемолиз, вызванный хлорпромазином. В хлорпромазиновом гемолизе фактором, вызывающим повреждения мембран эритроцитов, являются свободные радикалы, возникающие при фотолитическом распаде хлорпромазина (промазин-радикал, хлорпромазиновый катион-радикал). Водорастворимый растительный меланин гасит свободнорадикальные частицы и связывает свободнорадикальные метаболиты.
2. Гемолиз реактивом Фентона. Для проведения эксперимента были подобраны минимальные количества реагентов Фентона, вызывающие полный лизис 1% суспензии эритроцитов. Оптимальными оказались концентрации FeSO4•7H2O 0,01 мг/мл и H2O2 мг/мл (в пересчете на 100%), эти концентрации были использованы в эксперименте. Гемолиз учитывали через 24 часа. Водорастворимый растительный меланин предохраняет эритроциты от гемолиза, вызванного реактивом Фентона. Реагент Фентона широко используется для генерирования свободных радикалов, таких как гидроксильный радикал (HO*) и гидропероксид-радикал (HO2*). Свободные радикалы вызывают перекисное окисление липидов клеточных мембран и как следствие этого лизис клеток.
3. Иммунный гемолиз. В работе использовали кроличью гемолитическую сыворотку к эритроцитам барана с исходным титром 1:1200 в разведении 1:600 и стандартный комплемент морской свинки (разведение 1:1). К 7 мл 1% суспензии бараньих эритроцитов добавляли 1 мл гемолитической сыворотки и 0,025 мл раствора комплемента, смесь инкубировали 2 ч при 470С, измерение поглощения проводили через 2 ч. Водорастворимый растительный меланин до конечной концентрации от 0,001 до 0,1 мг/мл вносили в суспензию перед добавлением антител и комплемента. Иммунный гемолиз резко тормозится концентрацией 0,1 мг/мл водорастворимого растительного меланина.
4. Осмотический гемолиз. К суспензии эритроцитов добавляли равный объем дистиллированной воды и оставляли на сутки. В опыте к эритроцитам предварительно добавляют водорастворимый растительный меланин от 0,02 до 0,2 мг/мл. Установлено, что водорастворимый растительный меланин не влияет на осмотический гемолиз.
Водорастворимый растительный меланин защищает внутреннюю среду организма от токсического действия продуктов перекисного окисления, что подтверждают экспериментальные данные. Водорастворимый растительный меланин как живая система симбиотически связан с физиологическими системами регуляции и поддержки жизни клеток на молекулярном уровне. Меланиновая система и белковая система, параллельно поддерживают и предотвращают нарушение обмена жизненоважных процессов на молекулярном уровне.
Уникальный водорастворимый растительный меланин балансирует на молекулярном уровне работу клеток, органов, тканей. По совокупности действия на организм человека второго подобного вещества в природе нет.
Исследования физиологических и фармакологических свойств водорастворимого растительного меланина в следующих научных учреждениях:
1. Институт физики АН Украины г. Киев
2. Украинский институт экологии человека Украина г. Киев
3. Физико-химический институт Академии наук Украины, Одесса, отдел биологически активных веществ.
4. Институт экологии и токсикологии им. Л.И.Медведя Министерства Здравоохранения Украины г. Киев.
5. Одесский медицинский институт им. Пирогова, кафедра психиатрии.
6. Научно-исследовательский институт иммунологии и вирусологии, отдел иммунологии АН Украины, Харьков.
7. Академия Медицинских наук Украины, центр радиационной медицины, институт клинической радиобиологии, отдел эндокринологии.
8. Институт экспериментальной радиологии научного центра радиационной медицины, Украины, Киев.
9. Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого Национальной Академии Наук Украины, Киев.
10. Патент A61K31/48,3700.W092/07580. Бернулли Д.Л., Эрвин Р.Л., Макгел Д.Р., Терапевтическое применение меланина.
11. Патент RU2069697C1 Лях С.П., Булгак М.Л., Исаев А.Г., Вещество антиканцерогенного действия.
Токсикологические исследования водорастворимого растительного меланина провел Институт экологии и токсикологии Министерства Здравоохранения Украины г. Киев. Технические условия производства ТУУ 15.8-31904216.001-2002 Адсорбент «Меланин» утверждены Государственным комитетом Украины по стандартизации и сертификации Украинским государственным научно-производственным центром стандартизации, метрологии и сертификации. Зарегистрировано 31.07.2002 г. В книге учета за номером 081./026690. Разрешено решением государственной санитарно-гигиенической экспертизы от 20.06.2002 г. №5.10/22740. Для применения в пищевой промышленности. За подписью первого заместителя главного санитарного врача Украины С. П. Бережнов.
12. Патент Германии DE 102004003801 A1 автор патента и владелец Давиденко С.А. Зарегистрировано ТУ У 15.8-31904216.002-2006 Диетическая добавка «Меланиновый экстракт» на основе адсорбента «Меланин» для пополнения недостатка меланина в организме человека.