Клатрин-зависимое АР2 окаймление работает на плазматической мембране, обеспечивая селективное поступление грузов, использующих в основном рецептор-опосредованный эндоцитоз. Формирующийся транспортный пузырек в этом случае называется «окаймленной ямкой», или ОЯ (coated pit). Поскольку, в отличие от ранее описанных окаймлений, обслуживающих «внутренние» транспортные пути, это окаймление осуществляет связь клетки с внешним миром, оно устроено сложнее, и в большей степени подвержено регуляции.
Первым «сюрпризом» является то, что до сих пор неизвестна инициирующая малая ГТФаза, работающая с этим окаймлением. Однако, какая-то ГТФазная активность вовлечена в его сборку, поскольку при введении в клетку негидролизуемого аналога ГТФ, ГТФ-γS, АР2 собирается не на плазматической мембране, а на поздних мультивезикулярных эндосомах.
Выдвигалась гипотеза, в соответствии которой инициатором сборки окаймления может служить сам груз, вернее, лиганд-рецепторный комплекс. Строго говоря, полностью эту возможность исключать нельзя, однако надежно установленный факт попадания в один и тот же АР2-окаймленный пузырек рецепторов с различной внутриклеточной судьбой (например, метаболического рецептора трансферрина и сигнальных рецепторных тирозинкиназ) противоречит этой идее. Возможно, на фоне потока конститутивно собирающихся ОЯ (а в клетках фибробластов возникает по 2–3 тыс. ОЯ в минуту), небольшой стимулированный каким-либо рецептором вклад будет и незаметен.
Известно, что для АР2 весьма существенна динамика актина. Действительно, плазматическая мембрана отличается от эндомембран еще и наличием слоя кортикального цитоскелета, который любому пузырьку необходимо преодолеть для дальнейшего поступления вглубь клетки. Оказалось, что на мембране существуют области, «разрешенные» для формирования окаймленных ямок (размером 5–10 диаметров ОЯ), именно в пределах такой области и может инициироваться сборка новых окаймлений. Актиновый цитоскелет играет большую роль в стабилизации таких «зон эндоцитоза».
Сборка АР2-окаймления начинается с появления в «разрешенной зоне» мембраны липида фосфатидил-4,5-инозитолдифосфата (PI-4,5-P2) в результате действия фермента фосфатидилинозитолкиназы. РI-4,5-P2 узнают молекулы синаптотагмина, который, в свою очередь, имеет сродство к АР2 (рис. 18).
 |
(PI(4,5)P2)
Рис. 18. Инициация сборки окаймленной ямки
Одновременно на самом раннем этапе работают белки, которые определяют границу будущей территории инвагинации. Это АР180, имеющий самое высокое сродство к клатрину и, таким образом, работающий «затравкой» для новой решетки и вначале конкурирующий за клатрин с АР2.
Вторым ключевым игроком является эндофилин (endophilin). Этот белок обладает ацилтрансферазной активностью и способен модифицировать липид лизофосфатидную кислоту (LPA) – к его гидрофобному хвосту LPA добавляет остаток арахидоновой кислоты, обладающей менее упорядоченной структурой и большим диаметром. В результате мембрана в этом месте искривляется. Таким образом, начинается изменение кривизны мембраны формирующегося пузырька в области его границы.
В определение границ ОЯ вовлечен также комплекс «вспомогательных белков» (accessory proteins) Eps15/epsin, которые взаимодействуют с кортикальным актином и, что очень существенно, участвуют в сортировке груза, осуществляя своеобразный «фэйс-контроль». Параллельно с этими событиями к ямке привлекаются адапторные комплексы, за счет взаимодействия с ними накапливается груз. АР2 также рекрутируют из цитоплазмы клатриновые трискелионы, которые организуются в упорядоченную решетку. Каждую сторону гексамера организуют тяжелые цепи нескольких трискелионов. В среднем на 60 трискелионов в окаймленной везикуле приходится 20 адапторных комплексов.
Еще на стадии формирования, в состав растущей ОЯ включаются два белка, которые будут работать на последнем этапе формирования клатрин-окаймленной эндосомы ― амфифизин (amphyphisin) и динамин (dynamin). Этот комплекс и рекрутируются к «телу» пузырька благодаря сродству амфифизина к адаптинам. Динамин может взаимодействовать как с клатрином, так и с адаптинами и с фосфоинозитидами мембраны. По сути, он является ГТФазой, и далее мы подробно его охарактеризуем. Вначале он приходит на ОЯ в ГДФ-связанном виде, затем, по мере завершения сборки и увеличения кривизны мембраны динамин покидает комплекс с амфифизином, обменивает ГДФ на ГТФ и перемещается к горлышку уже почти сформированной везикулы. После гидролиза ГТФ динамин замыкает горлыщко, отшнуровывая окаймленную клатрином первичную эндосому от мембраны. Эта стадия называется фазой констрикции. Возможно, что дополнительный сигнал на отсоединение идет и с мембраны, поскольку одновременно фосфатаза синаптоджанин (synaptojanin) дефосфорилирует PI-4,5-P2, ликвидируя сайт инициации связывания синапотагмина.
Рис. 19. Цикл сборки АР2-окаймления
Также результатом дефосфорилирования этого липида является ослабление или прекращение взаимодействия с мембраной ряда белков окаймленной везикулы, в том числе динамина.
Как уже известно, клатрин обладает способностью к самосборке. Очевидно, что для снятия клатринового окаймления необходима затрата энергии, и поэтому в процесс разборки участвуют два белка – оксилин (auxilin) и шаперон Hsc70, или «раздевающая АТФаза» типа ААА (triple A). Разборка происходит очень быстро, поэтому в течение многих лет не удавалось выделить чистую фракцию клатрин-окаймленных первичных эндосом. Интересно, что оксилин способен взаимодействовать с динамином еще до фазы констрикции, а через него – и с Hsc70. Высказываются предположения, что энергия, выделяемая шапероном при гидролизе АТФ, может использоваться для реорганизации упаковки клатрина и переходу определенного числа гексамеров в клатриновой корзинке к пентамерам, что позволяет достичь практически идеальной шарообразной формы.
Кроме того, и после разборки шаперон может продолжать свою работу, оставаясь в комплексе с трискелионами и, таким образом, препятствуя их самопроизвольной агрегации в цитозоле. Однако, известно, что цитоплазматический пул клатрина состоит из фосфорилированных трискелионов, и, по-видимому, их фосфорилирует все тот же оксилин, являющийся протеинкиназой CGK (Cyclin G-associated kinase). При подавлении экспрессии оксилина в клетках наблюдали, произвольную самосборку пустых клатриновых корзиночек, несмотря на присутствие Hsc70. Кроме того, фосфорилированы и находящиеся в цитозоле адапторные комплексы. Возможно, роль фосфорилирования в сборке/разборке окаймлений до сих пор недооценена. Стоит вспомнить АР3 окаймление, в присутствии которого мембраны без клатрина искривляются столь же эффективно, как и в других случаях с клатрином. Работы последних лет все чаще демонстрируют участие протеинкиназ и фосфатаз в работе окаймлений, однако данные о координации, а также иерархии всех взаимодействий в ходе формирования окаймлений еще весьма отрывочны.
Как видно из приведенного описания, сборка клатрин-окаймленного пузырька включает несколько процессов, строго координированных во времени и локализации на самом пузырьке. Каким образом «оркеструется» вся эта масса событий, является одним из самых интригующих вопросов. Возможно, поиски ответа на этот вопрос следует искать в одной маленькой «подсказке», полученной из идентификации фуекциональных белков, взаимодействующих с адаптинами. Так, среди партнеров альфа-адаптина обнаруживаются АР180, Eps15 и epsin, amphiphysin и оксилин, т. е. белки, работающие последовательно. Самое интересное состоит в том, что эти белки связываются с одной и той же последовательностью «уха» альфа-адаптина. Учитывая то, что каждый из упомянутых белков имеет ряд «вторичных» эффекторов, взаимодействующих с ними посредством PRD-, EH-, NPF- и SH3-доменов, возникает возможность организовывать достаточно сложные регуляторные сети.
3.4.5. Динамин – атипичная ГТФаза.
Динамин-подобные белки
Среди всех ГТФаз, работающих в клетке, динамин стоит особняком, как по своим размерам (100 кДа) и доменной организации, так по ферментативной динамике. Действительно, если без помощи эффекторов самая «быстрая» малая ГТФаза своего суперсемейства – Ras, – теряет молекулу ГДФ за 9 ч, переходит в ГТФ-связанное состояние за 10 микросекунд, а гидролизует одну молекулу ГТФ за 50 мин, то динамину требуется 10 миллисекунд для диссоциации с ГДФ, 1 миллисекунда для ассоциации с ГТФ и 0,5–2 мин для гидролиза ГТФ. Т. е. динамин гидролизует ГТФ на порядок быстрее Ras-белка, а весь его цикл короче приблизительно в 300 раз!
N-конец динамина содержит ГТФазный домен, ближе к середине – РН-домен, позволяющий белку взаимодействовать с липидом PI-4,5-P2, а С-конец несет PRD-домен (proline rich domain), ответственный за белок-белковые взаимодействия. Среди его партнеров - амфифизины 1 и 2, синдапин/пасцин, сортирующий нексин 9 (sorting nexin 9, SNX9) и уже встречавшийся нам эндофилин.
Но самый важный домен, позволяющий динамину «откусывать» пузырьки от мембраны-донора, расположен между PH- и PRD-доменами. Это – GED-домен, выполняющий функцию внутреннего GEF. Стоит только представить себе, что две молекулы динамина расположились параллельно, но с таким сдвигом, что в образованном димере ГТФазый домен одной молекулы оказался рядом с GED-доменом другой, как сразу станет понятной высокая скорость гидролиза ГТФ. Учитывая способность к самосборке динамина в кольца и спирали, эта гипотеза весьма привлекательна. Однако существуют данные, что наиболее стабильной является тетрамерная конфигурация динамина, причем димер эндофилина существенно увеличивает способность к самосборке и ГТФазную активность динамина. Таким образом, вопрос структурной организации динаминового комплекса пока остается открытым.
Несомненной является способность динамина формировать спирали (или кольца в случае одного оборота) вокруг мембраны, причем шаг этой спирали (т. е. конформация динамина) зависит от того, в комплексе с каким нуклеотидом находится динамин. В ГДФ-связанной форме шаг гораздо меньше, чем в ГТФ-связанной форме. Следовательно, при гидролизе ГТФ спираль «распрямляется», и липидный бислой внутри нее вынужденно перестраивается. В случае быстрого гидролиза мембрана может разрываться, таким образом «стряхивая» пузырек с мембраны, а в случае медленного гидролиза, когда липиды успевают реорганизоваться без потери латеральных связей, будет происходить тубуляция мембраны.
Существует две изоформы динамина – динамин-1, экспрессирующийся в нейронах, и динамин-2, присутствующий в клетках всех тканей. Существуют также еще два динамин-подобных белка. Так, атластин 1 участвует в стабилизации тубул ЭПР и в организации сложной сети этих тубул, напрямую опосредуя (с участием гидролиза ГТФ) их гомотипическое слияние. Другой белок, Mdm1p, в олигомерном состоянии регулирует слияния и изменения кривизны мембран в кристах митохондрий. Его деятельность также определяется циклом гидролиза ГТФ.
Практически все данные по механизмам действия динамина касаются его роли в формировании эндосом, т. е. работе с АР2 окаймлением (и отчасти на синаптических эндосомах). Также предполагается его участие в отшнуровке кавеосом. К настоящему времени данных о механизмах замыкания горлышка других типов везикул и их отделении от мембран-доноров практически нет.
3.4.6. Механизмы сортировки грузов
в клатрин-окаймленные ямки
В соответствии с современными представлениями, трансмембранные рецепторы имеют определенную степень свободы перемещения в двумерной мембране. В ходе таких случайных перемещений они могут попадать в область формирующейся ОЯ и задерживаться там (секвестрироваться), либо свободно покидать ее, продолжая случайное движение.
Для секвестрирования используются несколько типов сортировки белков. В настоящее время известно, по крайней мере, 3 механизма сортировки рецепторов-грузов в ОЯ (рис. 20).
Во-первых, АР2 может узнавать сигнальную последовательность в цитоплазматическом домене рецептора, как правило, длинною в несколько аминокислотных остатков (содержащих либо дилейциновый мотив, либо тирозиновый). К этой группе в основном относятся метаболические рецепторы, которые постоянно локализуются в ОЯ, например, рецепторы трансферрина. При этом неважно, связан ли рецептор с грузом или нет.
Для рецепторов второго типа сигнальные последовательности играют незначительную роль, их заякоривание в ОЯ происходит через взаимодействие с вспомогательными белками (accesory proteins) Eps15/epsin. Этот механизм характерен для сигнальных рецепторов, обладающих тирозинкиназной активностью, и попадающих в ОЯ только в результате стимуляции после связывания с лигандом
Рис. 20. Механизмы сортировки грузов в ОЯ. 1 – АР-2
взаимодействуют с рецепторами, несущими дилейциновый
или тирозиновый мотив; 2 – узнавание убиквитинированных
рецепторов компонентами АР2-окаймления;
3 – взаимодействие GPCR с АР2 через аррестин
(фактором роста). В результате формирования лиганд-рецепторного комплекса тирозинкиназа активируется и фосфорилирует ряд белков, определяющих взаимодействие рецептора с компонентами ОЯ. Так, субстратом фосфорилирования является Eps15 и убиквитин-лигаза c-Cbl, убиквитинирующая сам рецептор. Такой рецептор задерживается в ОЯ благодаря наличию в составе ямки белков, аффинных к убиквитину.
Третья группа грузов – серпентиновые рецепторы, ассоциированные с тримерными G-белками (GPCR, G-protein coupled receptors) – связываются с АР2 через белок аррестин.
Вопрос о специфичности окаймленных ямок по отношению к тому или другому грузу остается открытым. С одной стороны, в одной и той же первичной эндосоме могут обнаруживаться и рецепторы трансферрина, и тирозинкиназные рецепторы. С другой стороны, практически все субъединицы адапторных комплексов имеют несколько изоформ, в результате набор несколько отличающихся по составу тетрамерных комплексов с различными преференциями по отношению к тому или иному грузу может быть довольно значительным.
Окаймления. Заключение
Суммируя сказанное в главе 3, можно отметить наиболее характерные черты строения и формирования окаймлений. Во-первых, «минимальная система» для сборки практически всех известных нам окаймлений содержит три основных компонента: это инициирующая малая ГТФаза (в основном – это Arf1), которая при переходе в активированную ГТФ-связанную форму рекрутирует различные белковые комплексы. Эти комплексы способны: (а) – взаимодействовать с определенными липидами мембраны и (б) – узнавать последовательности характерных для каждого окаймления грузов (мембранных белков или мембранных рецепторов растворимых белков). Для конститутивно транспортируемых грузов такого механизма секвестрирования оказывается достаточно, в случае же необходимости рекрутировать в формирующийся пузырек груз, в норме не находящийся там (стимулируемый связыванием с лигандами эндоцитоз сигнальных рецепторов), механизмы секвестирования могут быть гораздо более сложными.
Белковые компоненты окаймлений представляют собой комплексы, отдельные субъединицы которых обладают достаточно высокой степенью гомологии. Так, бета-субъединица СОРI-окаймления родственна бета1-4 субъединицам «клатриновых» окаймлений. Исключение представляет собой лишь белковые комплексы COPII, обеспечивающие упаковку вновь синтезированных в ЭПР белков.
Искривление мембраны в процессе формирования транспортного пузырька происходит в результате двух процессов: (а) возникновения тем или иным способом в области инвагинации модифицированных липидов, способных изменять геометрию мембранного участка и (б) за счет сил, развиваемых белковыми комплексами окаймлений при их ассоциации. Наибольшие силы развиваются клатриновыми окаймлениями.
Способность мультибелковых, ассоциированных с определенным участком мембраны, комплексов, избирательно связывать (и тем самым концентрировать) одни белки и исключать другие, позволяет им играть роль платформ, в пределах которых происходят процессы сортировки мембранных и мембранно-связанных компонентов. Такого рода платформы (в основном на эндосомах) способны организовывать и элементы COPI-окаймления, и, в большей степени, клатрин. В последнем случае в качестве адаптеров для связи плоской клатриновой решетки с мембраной используются белки HRS и семейство сортирующих нексинов (sorting nexins, SNXs). В ходе дальнейшего изложения роль таких «компартментов в компартменте» еще будет затрагиваться.
В заключение необходимо отметить, что далеко не все транспортные пути «приобрели» свои окаймления. Так, до сих пор остается неизвестным механизм инвагинации пиноцитозных пузырьков.
4. РЕГУЛЯЦИЯ СЛИЯНИЯ МЕМБРАН
Пропуская пока следующую логическую стадию транспортного процесса – перемещение везикулы с грузом от донорного компартмента к акцепторному, – перейдем к описанию механизмов, регулирующих слияние мембран.
В экспериментах in vitro с использованием бислойных липосом практически любого состава, инкубируя их в определенном объеме в течение достаточно длительного времени, можно добиться слияния некоторой доли везикул. Эффективность слияния, однако, будет не очень высокой, а сами слияния – неспецифическими. Задача же живой клетки – добиться того, чтобы сливались только определенные везикулы с конкретными компартментами и только тогда, когда это необходимо. Такие требования предполагают наличие сложно организованного регуляторного аппарата, реализующего общий принцип «в нужное время в нужном месте».
Для достижения этой задачи необходимо иметь механизм, (а) позволяющий транспортной везикуле с грузом (v, vesicle) узнать нужную мембрану-мишень (t, target), (б) закрепиться на ней, (в) образовать устойчивую суперпозицию v- и t-мембран друг против друга на определенном расстоянии и (г) провести слияние мембран, т. е. реорганизовать определенным образом оба липидных слоя. Кроме того, клетка должна иметь возможность разрешать или запрещать все эти процессы, а также регулировать их скорости.
Характеризуя слияния, их часто называют гомотипическим или гетеротипическим. В первом случае имеют в виду слияния везикул, состоящих из одинаковых мембран (например, эндосом с эндосомами, лизосом с лизосомами и т. д.) Во втором случае речь идет о мембранах, возможно, различающихся по составу (экзоцитозные пузырьки и плазматическая мембрана, везикулы из транс-Гольджи и эндосомы и т. д.). Таким образом, гомотипическое слияние происходит между везикулами, принадлежащими одному и тому же компартменту и имеющие одинаковый мембранный состав, а при гетеротипическом слиянии компартменты (и их мембраны, соответственно) разные. В случае гомотипического слияния обе мембраны содержат одни и те же регуляторы, и, по сути, являются одновременно и донорами, и акцепторами.
В настоящее время известны 2 основные системы, отвечающие в клетках эукариот за слияния мембран. Эти две системы в течение долгого времени служили причиной серьезнейших разногласий в стане исследователей. Действительно, еще в 70-е годы XX в. была идентифицирована группа малых ГТФаз Rab-семейства, которые без всякого сомнения регулировали слияния мембран. Так, экспрессия мутантного постоянно активированного (т. е. «запертого» в ГТФ-связанной форме) Rab5, приводила к появлению аномально крупных эндосом, а негативный ГДФ-связанный мутант вызывал везикуляцию эндосом, т. е. их фрагментацию. Тем не менее, регуляторный механизм работы Rab-белков оставался неясным. Высказывались предположения об использовании энергии гидролиза ГТФ для реорганизации бислоев при слиянии, однако экпериментально подтвердить эту гипотезу не удавалось.
С другой стороны, к 90-ым годам были выделены мембранно-связанные белки, получившие название SNARE, которые могли образовывать стабильные комплементарные специфические пары и в модельных системах in vitro вызывали быстрое слияние мембран. Выявление еще ряда белков, принадлежащих этой системе, позволило сформулировать совершенно очевидную и простую гипотезу регуляции слияния, которая на первый взгляд не требовала никаких дополнений. Дальнейшие исследования, однако, выявили ряд трудностей, которые в рамках SNARE-гипотезы объяснить не удавалось. Более того, две школы, в течение, по крайней мере, 10-ти лет не могли найти никаких точек пересечения. К настоящему моменту, к счастью, основные проблемы преодолены, и оба механизма заняли свои достойные места в общих представлениях о регуляции слияния мембран.
4.1. ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПОНЕНТОВ
СИСТЕМЫNSF-SNAP-SNARE
Хотя эта система была идентифицирована позже Rab-белков, для ясности изложения мы опишем ее первой. Ранние работы показали, что в клетках имеются мембранно-связанные белки различной молекулярной массы – от 18 до 40 кДа, которые способны образовывать высокостабильные комплементарные пары, и, будучи локализованы на разных везикулах (в искусственных системах), способны приводить к слиянию этих везикул. В живых системах один партнер должен был находиться на транспортной везикуле (vesicle) и поэтому назывался v-SNARE, а другой – на мембране-мишени (target), и вследствие этого именовался t-SNARE. Номенклатура этой системы поставлена «с ног на голову», поскольку расшифровку аббревиатур приходится начинать с наименее существенного элемента, который был идентифицирован первым. Это NSF (N -ethylmaleimide s ensitive f actor), цитоплазматический белок, работа которого блокируется при добавлении восстанавливающего агента N-этилмалеимида. Следующим был выделен цитоплазматический белок, связывающий NSF, – SNAP (s oluble N SF a ttachment p rotein). Белки же, играющие ключевую роль в слиянии мембран, называются всего лишь SNA P re ceptors, или SNARE (англ. «ловушка»). Поскольку эти белки часто выделялись вместе, сформировалось представление о том, что их участия достаточно для слияния. А сам комплекс из NSF, SNAP и 2х комплементарных SNARE получил название «частицы слияния», или “20S fusion particle”.
NSF образует плоское кольцо (цилиндр) из 6 субъединиц молекулярной массой 75 кДа каждая и относится к классу ААА АТФаз, часто называемых «раздевающими». С одной из таких АТФаз, оксиллином, мы уже сталкивались ранее. NSF связывается с белком (или белками) с помощью доменов, локализованных на внешнем крае цилиндра. При гидролизе АТФ субъединицы изменяют конформацию, разворачиваясь таким образом, что домены, связанные с белками, оказываются на большем расстоянии от центра цилиндра, чем до гидролиза. Таким образом, действие этой АТФазы может приводить к разрыву связей между белками в комплексе, с которыми она была ассоциирована.
NSF очень консервативен и обслуживает большинство процессов слияния в клетках разных типов. Однако существует два так называемых NSF-подобных белка, которые работают на специализированных участках транспортных путей в определенный момент жизни клетки. Это р97, занимающийся постмитотической сборкой аппарата Гольджи; он не требует SNAP, по крайней мере, в системах in vitro. Второй белок – это Cdc48, обеспечивающий гомотипическое слияние везикулярных фрагментов ЭПР и ядерной оболочки после митоза. Как видим, оба белка относятся к комплексу регуляторов митоза и постмитотических событий.
SNAP существует в трех версиях, при этом альфа-SNAP универсален, тогда как бета- и гамма-изоформы тканеспецифичны.
И наконец, SNAREs – гетерогенная группа мембранных белков (18–47 кДа), способных образовывать высокостабильные компартмент-специфические комплементарные пары; они заякорены в мембране с помощью коротких хвостов (белковых или изопренильных). Количество известных SNAREs превышает несколько десятков. По первой классификации рецепторов их делили на две группы: v-SNARE (к ним относят семейство VAMP (vesicle-attached membrane proteins)), и t-SNAREs (target SNARE), включающие два семейства – синтаксины (syntaxins) и SNAP25. Следовательно, один компартмент может содержать более чем один рецептор. Этот момент, также как и отсутствие видимых гомологичных последовательностей в цитоплазматических доменах SNARE, долго вызывали значительные сомнения, хотя первоначальная гипотеза работы «фьюзогенной машины» казалась совершенно очевидной.