Известно, что при культивировании in vitro человеческие фибробласты после 60-70 делений перестают размножаться и останавливаются, преимущественно в G1 фазе клеточного цикла. Очень редко, примерно в одной клетке из нескольких миллионов, происходят спонтанные мутации, отменяющие остановку клеточного цикла. Однако потомки этой клетки делятся еще порядка 10 раз и снова останавливают свое размножение, а затем постепенно гибнут. Первая остановка клеточного цикла получила название "ранний кризис", или стадия М1, а вторая остановка и гибель клеток стали определяться термином "кризис", или стадия М2 репликативного старения. В пользу того, что остановка и гибель клеток связана именно с числом предшествующих клеточных делений, а не просто с астрономическим временем, проведенным вне организма, в условиях in vitro, свидетельствует две группы фактов. Во-первых, в культурах фибробластов, полученных от эмбрионов или от молодых людей, кризис наступает позже, чем в культурах фибробластов, полученных от пожилых людей. Во-вторых, если до наступления стадии М1 фибробласты не пересаживать, они образуют плотную культуру и, в результате контактного торможения, остановятся в G1. В этом состоянии они могут находиться довольно долго, по крайней мере 2-3 месяца, а затем, после пересадки, снова начнут размножаться до тех пор, пока не пройдут свои 60-80 делений. В это время их аналоги, не останавливавшие свое размножение, уже давно погибли. Таким образом, астрономическое время пребывания в культуре может быть увеличено, а неизменным остается число клеточных делений до наступления кризиса. Если же какие-то клетки избегают кризиса (спонтанная частота такого события настолько низка, что ее даже трудно зарегистрировать, но определенные манипуляции с геномом или экспрессия некоторых клеточных и вирусных онкогенов могут значительно увеличить вероятность этого события), то клетки могут уже размножаться бесконечно долго. Это определяется термином иммортализация клеток, т.е. приобретение бессмертия.
В основе счетно-ограничительтного механизма, детерминирующего репликативное старение клеток, лежит прогрессивное укорочение теломер (концевых участков хромосом) по мере деления клеток. ДНК теломер, представляющая собой более тысячи повторов гексануклеотида TTAGGG, в силу известной проблемы репликации концов линейной ДНК, синтезируется не полностью, и при каждом акте репликации, т.е. после каждого клеточного деления, теломеры укорачиваются. Согласно теломерной гипотезе прогрессивное укорочение теломер приводит к тому, что они достигают какой-то критической минимальной длины, когда сенсорные системы начинают распознавать их как аномальные структуры ДНК и индуцировать остановку клеточного цикла, подобно тому, как это происходит при ДНК-повреждающих воздействиях. Именно это, как сейчас предполагается, и вызывает фазу М1 репликативного старения (ранний кризис). При нарушениях в сигнальных системах, детерминирующих остановку клеточного цикла, клетки с укороченными теломерами будут продолжать делиться, пока теломеры практически не исчезнут и перестанут выполнять свои функции, т.е. предотвращать рекомбинации и слипание хромосом. Тогда хромосомы потеряют свою целостность и наступит так называемая генетическая катастрофа, или стадия М2 репликативного старения (Рис.7).
Рис. 7. Теломерный механизм репликативного старения клеток человека
Отсутствие в опухолевых клетках человека репликативного старения (иммортализация) связано с включением специального механизма. В его основе лежит способность специфического фермента теломеразы достраивать недореплицированные теломерные повторы и поддерживать таким образом их постоянную длину. Теломераза состоит из нескольких субъединиц, включая РНК-матрицу и TERT (Telomerase Reverse Transcriptase), представляющую собой обратную транскриптазу, синтезирующую ДНК повторов гексануклеотида TTAGGG с РНК-матрицы. Предполагается существование и других, т.н. ALT (альтернативных) механизмов поддержания длины теломер, основанных на гомологичной рекомбинации ДНК теломер. Включение экспрессии TERT, каталитической субъединицы теломеразы, индуцируется изменением экспрессии определенных онкогенов (см. раздел II.2) или опухолевых супрессоров. Так, оно может быть вызвано активацией онкогена Myc и инактивацией опухолевого супрессора р53. Кроме этого, существенный вклад в иммортализацию неопластических клеток вносят нарушениями работы охранных механизмов, осуществляющих остановку клеточного цикла при нарушения структуры ДНК, в частности при исчезновении теломерных повторов (см. раздел 1.2.1).
При обычных условиях культивировании in vitro в некоторых типах клеток человека, например в эпителиоцитах, наблюдается остановка клеточного цикла через 10-15 делений - т.н. фаза М0 репликативного старения. Такая остановка не связана, по-видимому, с изменением длины теломер, а обусловливается активацией CKIs, в частности p16INK4a, в ответ на какие-то внутриклеточные изменения, вызываемые неадекватностью условий in vitro. Так фаза М0 в кератиноцитах или эпителиоцитах молочной железы может быть отменена при культивировании их на подложке фибробластов в среде без сыворотки, но с достаточным содержанием набора определенных факторов роста. Сходная ситуация наблюдается в культурах фибробластов и других клеток грызунов, которые входят в кризис через 10-15 делений in vitro несмотря на очень большую длину теломер и высокую активность теломеразы в подавляющем большинстве клеток. Как и в случае эпителиальных клеток человека, кризис в клетках грызунов может быть предотвращен подбором адекватных условий культивирования (определенный для каждого типа клеток внеклеточный матрикс и набор цитокинов), в связи с чем он получил название "культуральный шок" (culture shock). Таким образом, совсем недавно выяснилось, что у клеток грызунов, в отличие от клеток человека, нет механизма подсчета числа делений (т.е. они как бы изначально иммортализованы благодаря конститутивной активности теломеразы, поддерживающей довольно большую длину теломер), а их репликативное старение представляет собой артефакт, связанный с неадекватностью условий in vitro. Описанные ранее события, вызывающие иммортализацию фибробластов грызунов (инактивация опухолевых супрессоров р53, pARF) или отмену фазы М0 в эпителиоцитах человека (инактивация опухолевых супрессоров p16Ink4a, pRb) предотвращают активацию чекпойнтов клеточного цикла в ответ на внутриклеточные изменения, накапливающиеся при неправильном культивировании клеток. Кроме того, они могут отменять индукцию терминальной дифференцировки факторами сыворотки крупного рогатого скота, которая является причиной артефактного репликативного старения некоторых типов клеток, например крысиных олигодендроцитов и шванновских клеток.