Клеточные мембраны замкнуты, они имеют внутреннюю и внешнюю поверхности, различающиеся по липидному и белково- му составу – эту особенность мембран называют трансмембранной асимметрией. Характерная особенность биологических мембран – различный состав липидов по обе стороны бислоя. Известно не- сколько механизмов, обеспечивающих асимметричное распределе- ние фосфолипидов в мембране. Один из них связан с термодина- мической вероятностью распределения липидов в соответствии со стереоконфигурацией их молекул. Асимметрия липидов возника- ет, прежде всего, потому, что в случае замкнутого мембранного бислоя липиды с более объемными полярными «головками» стре- мятся находиться в наружном монослое, так как там площадь по- верхности, приходящаяся на полярную «головку», больше. По этой причине фосфатидилхолины и сфингомиелины локализованы преимущественно в наружном монослое, а фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин, в основном, во внутреннем. Это, соответ- ственно, приводит к различиям в заряде фосфолипидов и различ- ной гидратации их полярных «голов» по обе стороны бислоя. 43 Второй механизм реализуется за счет различий в составе среды по обе стороны бислоя в условиях нативной клетки. С внеклеточной стороны мембрану омывает среда с высоким со- держанием натрия и кальция, а со стороны цитоплазмы мем- брана контактирует с магнием и калием. Различия ионного со- става вне- и внутриклеточной среды вносят вклад в создание и поддержание изгибов, то есть в асимметрию бислоя. Именно этот фактор обеспечивает создание градиента кривизны, скла- док, сморщиваний, отшнуровку частей биологической мембра- ны в виде везикул. 4.2.3. РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫПОДВИЖНОСТИ КОМПОНЕНТОВ ЛИПИДНОГО БИСЛОЯ Молекулам в изотропной жидкости присущи разные виды под- вижности: вибрационные колебания, вращение, трансляционные движения. В анизотропном бислое, напротив, молекулярная под- вижность его компонент упорядочена. Различные типы подвижно- сти проиллюстрированы на рис. 17. Молекулы фосфолипидов способны к нескольким видам под- вижности в бислое: 1) изменение ориентации полярных голов 2) латеральное движение, 3) колебания ацильных цепей, 4) образование кинков и их перемещение вдоль ацильных цепей (в поперечном направлении), 5) ротационная подвижность (вращение вокруг длинной оси), 6) переход с одной стороны бислоя на другую (по типу флип- флоп), 7) выход из бислоя. Рассмотрим некоторые виды подвижности молекул фосфолипи- дов подробнее. 44 Латеральное движение. Способность липидов переме- щаться в мембране в лате- ральном (продольном) на- правлении показана многими экспериментами. Например, для суспензии яичного леци- тина при 25ºС молекула пре- одолевает путь, равный 2,5 мкм за 1 сек. Таким образом, латеральная диффузия в упо- рядоченной мембране позво- ляет веществам перемещаться с относительно высокой ско- ростью. Она делает возмож- ным образование липидных кластеров. Латеральная диф- фузия оказывается возможной даже при температуре кри- сталлического состояния. По- видимому, единственный ме- ханизм, который мог бы удов- летворительно объяснить этот факт, заключается в латераль- ной неоднородности мембра- ны, наличии дефектных зон (пустот), куда могут вытесняться молекулы из соседних упорядоченных областей. Упорядоченность мембран, измеряемая с помощью ЭПР спек- троскопии, снижается при движении к метильному радикалу ацильной цепи, что свидетельствует об увеличении подвижности жирнокислотных цепей в этом направлении. Различные конфигурации молекул жирных кислот, возни- кающие при поворотах (вращении) вокруг единичной С-С свя- зи, называют ротамерами, или конформерами, а изменение конформации молекулы за счет таких поворотов носит назва- ние транс-гош изомеризации. Вращательная подвижность мо- Рис. 17. Виды подвижности липидных компонентов в бислое I – изменение ориентации по- лярных голов, II – быстрая лате- ральная диффузия в двумерном пространстве бислоя, III – быст- рые колебания жирнокислотных цепей, IV – образование кинков и их продвижение по ацильным цепям, V – вращательная под- вижность вокруг длинной оси, VI – медленный обмен между компонентами монослоев мем- браны. 45 лекул фосфолипидов, измеренная методом ЯМР, показала, что подвижность гидрофобных сегментов цепи повышается в на- правлении от сложноэфирной связи к метильной группе, т.е. к центру бислоя. Трансмембранный переход «флип-флоп» типа. В липидных ис- кусственных мембранах такие переходы осуществляются весьма медленно, например, полупериод перехода молекул холестерина с одной стороны бислоя на другую в липосомах из фосфатидилхоли- на занимает более 24 часов, однако, в принципе, такой переход воз- можен. Молекулы липидов не могут преодолеть липидный бислой в поперечном направлении путем перескока молекул с одной стороны бислоя на другую (флип-флоп), если в молекуле нет особых фер- ментов, известных под названием транслокаторов. Липиды и в био- логических мембранах с довольно большой частотой мигрируют с одной стороны мембраны на другую, то есть совершают «флип- флоп» переходы. Возможно, что гетерогенность липидного состава биологических мембран увеличивает вероятность «флип-флоп» пе- рехода в природных мембранах. Одним из результатов этой гетеро- генности является возможность образования гексагональной фазы (вывернутых везикул), кратковременное существование которых позволяет вовлекать молекулы липидов с одной стороны бислоя, а возвращать их на другую. Следовательно, динамическое состояние бислоя с высокой под- вижностью его компонентов определяется одновременно нескольки- ми факторами. С одной стороны, это вращательная подвижность от- дельных молекул фосфолипидов. Вблизи метильного конца она осу- ществляется для каждой молекулы независимо, но с приближением к полярной «голове» и возрастанием плотности упаковки (особенно на- чиная с 9 углеродного атома, ближе которого к поверхности бислоя не встречается цис-двойных связей) подвижность уменьшается. 4.2.4. ДЕФЕКТНЫЕ ЗОНЫ. РОЛЬ ХОЛЕСТЕРИНА Различные виды подвижности липидных компонентов в бислое нарушают гомогенную упаковку и приводят к образованию раз- личных дефектов. Высокая скорость вращения жирнокислотных радикалов вокруг С-С-связей, а также наличие в мембране в со- 46 ставе фосфолипидов цис-изомеров ненасыщенных жирных ки- слот делают бислой достаточно рыхлым. Образование дефектов такого рода демонстрирует рис. 18. Рис. 18. Образование дефектов в мембранном бислое А – обе жирнокислотные цепи молекулы фосфолипида находятся в транс-конфигурации, вращение вокруг С-С связей, указанное круговыми стрелками, ничем не ограничено (I); в результате несогласованного вра- щения образуется скошенная (гош-) конформация (II) или кинк (III); Б – влияние кинков на упаковку бислоя: I – кинки отсутствуют, II – один кинк на жирнокислотную цепь, III – два кинка на жирнокислотную цепь. Рассмотрим сначала насыщенные углеводородные цепи. Наиболее стабильна транс-конформация (I), в которой цепь максимально вытя- нута и не меняет своего направления, тогда как в гош-конформации ее направление меняется (II) и образуется дефект упаковки. Последова- тельность гош-транс-гош для трех смежных С-С связей приводит к по- явлению в цепи излома (кинка), в результате чего участки цепи выше и ниже цепи излома оказываются значительно смещенными друг отно- сительно друга (III) – образуется дефект. Возможность образования та- ких структур обеспечивает возникновение подвижных дефектов, спо- собных захватывать целые блоки мембраны – кластеры. Их концентра- ция и подвижность зависит от температуры. В случае ненасыщенных жирных кислот почти все двойные связи в мембранных липидах находятся в цис-форме. Как и в слу- чае гош-формы, это приводит к изменению общего направления цепи – образуется дефект (рис. 19). Такие пространственные де- 47 фекты бислоя, индуцируемые включением в него ненасыщеных жирных кислот, являются более стабильными. В результате появ- ления дефектов бислой становится более рыхлым. Рис. 19. Изменение упаковки бислоя при термоиндуцированном фазовом переходе (от А к Б) и при встраивании в бислой молекул холестерина (от Б к В) Указаны толщина бислоя в ангстремах и площадь сечения, зани- маемая каждой молекулой фосфолипида. Рассмотрим вызванное дефектами изменение геометрии бислоя. Растянутая углеводородная цепь жирной кислоты, со- держащая 18 углеродных атомов, имеет длину примерно 23– 24 Å, что возможно в случае геля, то есть в случае высоко- структурированного (упорядоченного) состояния липидов. По этой причине можно было бы предположить, что бислой, со- ставленный из фосфолипидов, жирные кислоты которых со- держат 18–20 углеродных радикалов, должен иметь толщину более 47 Å. Однако реальная толщина мембраны редко превы- шает это значение (она составляет на 15–20% меньшую вели- чину). Это указывает, что жирнокислотные радикалы бислоя не распрямлены полностью, а образуют рыхлые структуры. Из-за этого факта площадь мембраны оказывается несколько большей, чем следует из расчета теоретического пространст- ва, приходящегося на одну молекулу фосфолипида. Встраива- ние холестерина в бислой делает возможным изменение фор- мы мембран в результате значительной деформации обеих сторон липидного бислоя, так как в отличие от фосфолипидов холестерин может легко перемещаться из одного монослоя в 48 другой. При таких воздействиях и толщина бислоя несколько возрастает. Наличие в углеводородных цепях кинков, двойных связей (и других особенностей) приводит к увеличению площади поперечного сечения цепи (минимальное ее значение составляет около 19 Å2) при полно- стью транс-конфигурации; это может иметь важные последствия для упаковки липидов в бислое. В жидкокристаллической фазе появление в цепи гош-конформеров увеличивает эффективное поперечное сече- ние цепей по меньшей мере до 50 Å2. Толщина бислоя уменьшается за счет наличия в цепях гош-конформеров, приводящих к разупорядочи- ванию цепей, причем сами цепи в целом растянуты и расположены перпендикулярно поверхности бислоя. В фазе геля насыщенные углеводородные цепи фосфолипидов находятся преимущественно в полностью транс-конформации. Минимальная площадь поперечного сечения молекулы диацильно- го фосфолипида равна около 38 Å2. Примерно такую же площадь занимает полярная головка фосфатидилэтаноламина, поэтому на- сыщенные фосфатидилэтаноламины в фазе геля упаковываются так, что их ацильные цепи располагаются перпендикулярно плос- кости бислоя (как в липидных кристаллах). На рисунках и схемах цепи фосфолипидов в бислое, как прави- ло, представляют скошенными относительно перпендикулярной оси мембран. Угол наклона цепей определяется природой поляр- ной головы молекулы: наклон возникает в том случае, если объем гидратированной головы молекулы больше площади сечения ее хвостовой части. Например, в случае кристаллов фосфатидилхоли- на минимальная площадь, приходящаяся на одну полярную голов- ку, составляет примерно 50 Å2. Поэтому дипальмитоилфосфати- дилхолин (38 Å2) в фазе геля не может упаковываться так, как фос- фатидилэтаноламин. В этом случае ацильные цепи дипальмитоил- фосфатидилхолина отклоняются на 30о от нормали к бислою, бла- годаря чему их поперечное сечение увеличивается и достигается соответствие размеру полярной головки. При этом углеводород- ные цепи сохраняют полностью транс-конформацию. В случае, когда эти величины равны (например, для фосфатидилэтанолами- на), скоса практически не наблюдается. 49 Наличие перечисленных особенностей обеспечивает определен- ную рыхлость упаковки (микровязкость) мембранного бислоя при нормальных условиях. 4.2.5. МИКРОВЯЗКОСТЬ МЕМБРАН Для мембран характерна высокая степень текучести бислоя, обеспечивающая способность липидов и белков к латеральной диффузии. Повышенная плотность упаковки (структуризация) бис- лоя увеличивает сопротивление диффузии молекул, транспорти- руемых через мембрану, повышает ее микровязкость. Так что ско- рость перемещения молекул зависит от микровязкости мембран, которая, в свою очередь, определяется относительным содержани- ем насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в составе липи- дов. Микровязкость мембран меньше, если в составе липидов пре- обладают ненасыщенные жирные кислоты, и больше при высоком содержании насыщенных жирных кислот. На этот параметр влия- ют также размеры углеводородных «хвостов» липидов, с увеличе- нием длины которых микровязкость бислоя уменьшается. 4.2.6.ФАЗОВЫЕ ПЕРЕХОДЫМЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ В водной среде различные структуры (рис. 20), образуемые фосфолипидами (ламеллярные, мицеллярные, гексагональные) ве- дут себя как жидкие кристаллы, то есть анизотропные жидкости, обладающие признаками упорядоченности. Таким структурам присущи лиотропный мезоморфизм (зависи- мость структуры от гидратации) и термотропный мезоморфизм (зависимость структуры от температуры). Представления о лио- тропном и термотропном мезоморфизме как свойствах мембран связаны между собой. Фазовые переходы липидов, осуществляю- щиеся по типу «гель – жидкий кристалл», происходят при темпе- ратуре (Ткр), величина которой зависит от содержания воды в сис- теме. Ткр достигает минимума, как только общее содержание 50 Рис. 20. Структуры, образуемые в водных суспензиях липидами, склонными к созданию ламеллярных образований (А) и небислойных гексагональных образований (Б) воды превышает то количество, которое могут связывать липидные структуры. Фазовая диаграмма для яичного лецитина, характеризующая соотношение различных мезо- форм этого липида в разных ус- ловиях представлена на рис. 21. Примером того, как суще- ственно влияет вода на фазо- вые переходы, является мо- дификация фазового сос-тоя- ния мембраны под влиянием перекисного окис-ления ли- пидов (ПОЛ), когда Ткр сни- жается. Это явление объясня- ется увеличением содержа- ния воды в бислое. Почему это происходит? Гидратация бислоя зави- сит от присутствия заряжен- ных фосфолпидов, наиболее сильно она возрастает при индукции ПОЛ. Образую- Рис. 21. Фазовая диаграмма смеси яичного лецитина с водой I – жидкокристаллическое сос- тояние, бислой; II – двуфазная система: вода-бислойные струк- туры; III – область сосу- ществования ламеллярных и гексагональных структур; IV – гель. Ткр – кривая температуры фазового перехода. 51 щиеся в качестве промежуточных продуктов гидроперекиси явля- ются высоко гидрофильными, они эффективно разрушают бислой, увеличивая доступность гидрофобных доменов мембраны для мо- лекул воды. Именно по этим причинам ПОЛ имеет такое «разру- шительное» влияние на мембранные структуры. В момент фазового перехода бислоя происходит несколько одно- временных событий: возрастает подвижность полярных -N+ -(CH3)3- групп; увеличивается вращательная подвижность С-С связей, что при- водит к облегчению транс-гош перехода и образованию кинков; уве- личивается скорость латеральной диффузии молекул (рис. 22). Следст- вием этого являются два важных обстоятельства: изменение геометри- ческих размеров бислоя, которое объясняется латеральным расшире- нием площади, занимаемой каждой молекулой фосфолипидов, увели- чением гидрофобного объема мембраны. Рис. 22. Схематическое изображение четырех фазовых состояний ламеллярного бислоя, образованного чистым димиристоилфосфатидилхолином Сплошная стрелка обозначает быстрые (порядка минут или меньше), а пунктирная – медленные (порядка месяцев) переходы. 52 Рис. 23. Разделение фаз в гетерогенном бислое (А) с одновременным фазовым переходом части бислоя (Б) под влиянием температуры Из-за неодновременности проявления этих свойств в ходе фазовых перестроек бислоя более упорядоченные области мем- браны сосуществуют с уже расплавленными – наблюдается фа- зовое разделение (рис. 23). В этих условиях для мембраны характерно существование разного рода дефектов, индуцирующих взаимодействие белко- вых молекул друг с другом, встраивание в бислой соединений, повышение проницаемости для ионов и т. д. Фазовые переходы, индуцируемые температурой, – объек- тивная характеристика бислоя, состоящего из одного или не- скольких (не больше 2–3 компонентов). В случае гетерогенных систем методы регистрации дают результаты, не поддающиеся однозначной интерпретации. Фазовые переходы в мембране индуцируются не только изменениями температуры. Они мо- гут быть вызваны сдвигом pH среды, электрическим потенциа- лом, двухвалентными катионами, способствующими образова- нию кластеров определенных фосфолипидов и разделению фаз; фазовые переходы также сопровождают действие гормо- 53 нов на биологические мембраны. Таким образом, исследование термотропных переходов имеет не только теоретическое значе- ние: аналогичные переходы осуществляются в биологических системах при подготовке животных к гибернации или выходе из зимней спячки, при термоадаптациях, адаптации мигрирую- щих рыб к морской воде и т. д. Кроме перехода типа «гель – жидкий кристалл» липиды мо- гут претерпевать превращения другого рода, приводящие к об- разованию гексагональной фазы НII (рис. 20). Эти небислойные структуры легко образуют короткоцепочечные фосфолипиды с полярными головами (например, фосфатидилсерин, фосфатид- ная кислота). Образованию гексагональных структур способст- вуют такие явления как повышение температуры, увеличение ненасыщенности жирнокислотных цепей, высокая ионная сила при щелочном рН, а также понижение гидратации бислоя. Пе- реход отдельных участков бислоя в фазу НII приводит к нару- шению целостности мембраны, формированию каналов прони- цаемости, образованию дефектных зон. В искусственных мембранах были зарегистрированы пере- ходы такого рода. В нативных мембранах, вероятно, они также могут образовываться. Для мембран хлоропластов переходам бислоя в гексагональную НII–фазу приписывается важная регу- ляторная роль. Предполагают, что в мембранах саркоплазмати- ческого ретикулума мышц такие переходы могут индуциро- ваться в результате ферментативного обмена жирнокислотны- ми цепями между длинноцепочечными фосфатидилсерином и короткоцепочечным фосфатидилхолином. В мембранах эубактерий обнаруживается большое количе- ство липида, склонного к образованию гексагональных струк- тур – плазменилэтаноамина. Превращение его в глицероаце- тальплазмалоген препятствует образованию фазы НII. Обрат- ная реакция, выражающаяся в увеличении ненасыщенности мембранных компонентов и «разрыхлении» ее структуры, ин- дуцирует образование гексагональной фазы в мембране. Как уже упоминалось, гексагональная фаза может облегчать флип- флоп переходы липидных молекул. 54 4.2.7. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ МЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ Микровязкость и фазовые переходы липидов определяют функ- циональную динамичность мембраны. Совершенно очевидно, что липидный состав различных мембран не является случайным, од- нако удовлетворительного объяснения этому феномену не найде- но. Клеточная мембрана может содержать более 100 разных типов липидных молекул. Почему их так много и почему каждая мембра- на имеет уникальный липидный состав, пока неясно. Но становит- ся все более очевидным, что липиды активно участвуют в процес- сах, протекающих в мембранах. Рассмотрим некоторые факторы, возможно, предопределяющие липидный состав мембраны. 1. Смесь липидов обязательно должна быть способна образо- вать стабильный бислой, в котором могли бы функционировать белки. 2. Некоторые липиды способствуют стабилизации сильно ис- кривленных участков мембраны, образованию контакта между мембранами или связыванию определенных белков, поскольку форма этих молекул благоприятствует нужной упаковке бислоя на соответствующих участках мембраны. 3. Некоторые липиды являются важными биорегуляторами. Наиболее изучена в этом отношении регуляторная роль произ- водных фосфатидилинозитола в плазматических мембранах клеток эукариот. Некоторые мембранные липиды являются предшественниками вторичных посредников при передаче гормонального сигнала. Так, фосфатидилинозитол-4,5-бисфос- фат (ФИФ2) под действием фермента фосфолипизы С гидроли- зуется до диацилглицерола, ДАГ, активатора протеинкиназы С, и инозитол-1,4,5-трисфосфата (ИФ3) – регулятора кальцие- вого обмена в клетке (см. раздел 8). ДАГ, ИФ3, протеинкиназа С и Са2+ – участники фосфоинозитольной системы передачи сигнала, причем два первых образуются из мембранных ком- понентов, третий являетcя мембраносвязанным белком, а по- следний (кальций) – является ионом, проникающим через спе- циальные каналы на клеточной мембране и запускающим этот процесс. 55 4. Некоторые липиды участвуют в реакциях биосинтеза. Напри- мер, в клетках E. сoli фосфатидилглицерол поставляет глицерофос- фатный фрагмент при биосинтезе периплазматических олигосаха- ридов. 5. Отдельные липиды необходимы для поддержания оптималь- ной активности ряда ферментов. Они формируют среду для функ- ционирования мембранных белков, способных принимать натив- ную конформацию лишь в гидрофобном окружении. Выделенные из мембран ферменты, лишенные липидного окружения, как пра- вило, не проявляют каталитической активности, или изменяют ее при изменении гидрофобности среды. Такова, например, митохон- дриальная креатинкиназа, фермент, катализирующий образование креатинфосфата. Для проявления ее нормальной активности требу- ется взаимодействие с кардиолипином внутренней мембраны ми- тохондрий. 6. Ганглиозиды (гликолипиды), как полагают, играют важную роль в регуляции роста клеток, являются специфическими рецеп- торами в плазматической мембране и ответственны за клеточную адгезию. 7. Кроме того, некоторые липиды выполняют «якорную» функ- цию, например, к молекуле фосфатидилинозитола через олигоса- харид могут присоединяться специфические белки наружной по- верхности клетки – образуется фосфатидилинозитолгликан. При- мер такого заякоренного белка – ацетилхолинэстераза, катализи- рующая гидролиз ацетилхолина в синаптической щели. Этот фер- мент фиксируется на постсинаптической мембране, ковалентно присоединяясь к фосфатидилинозитолгликану. При участии фос- фолипазы С (гидролизующей мембранные липиды) может проис- ходить модификация мембраны и отделение белков от внешней поверхности клетки. 8. Липиды могут быть аллостерическими активаторами мем- бранных ферментов. Фермент протеинкиназа С катализирует реак- ции фосфорилирования белков. В неактивной форме протеинкина- за С находится в цитозоле. Однако после стимуляции клетки (по- вышении в клетке концентрации кальция) фермент быстро активи- руется ионами кальция и оказывается связанным с мембраной. 56 Функционально активная протеинкиназа С – комплекс, содержа- щий мономер фермента, молекулу диацилглицерола, один или бо- лее ионов кальция и четыре молекулы фосфатидилсерина. Экспериментально было показано, что организмы часто мо- гут выдерживать, причем без всяких последствий, существен- ные изменения липидного состава мембран. Например, с помо- щью генетической трансформации можно получить жизнеспо- собный штамм E. coli, в мембранах которых содержится до 34% фосфатидной кислоты, обычно отсутствующей в штаммах дикого типа. Очевидно, тот липидный состав, который харак- терен для штаммов дикого типа, не является обязательным для выживания клеток, по крайней мере, в условиях их выращива- ния в лаборатории. 4.3. УГЛЕВОДЫМЕМБРАН Другой мембранный компонент, углеводы, в составе мем- бран обнаруживаются лишь в соединении с белками (глико- протеины и протеогликаны) и липидами (гликолипиды). В мембранах гликозилировано около 10% всех белков и от 5 до 26% липидов (в зависимости от объекта). В числе углеводных компонентов – глюкоза, галактоза, нейраминовая кислота, фу- коза и манноза. В составе соединительной ткани и межклеточного вещества обнаруживаются протеогликаны: углеводные компоненты в них сульфатированы. Их типичными представителями являют- ся хондроитинсульфат, дерматансульфат и гепарансульфат. Углеводные компоненты мембранных структур в подав- ляяющем большинстве открываются во внеклеточную среду. Их функции связаны с контролем за межклеточными взаимо- действиями, поддержанием иммунного статуса клетки, обеспе- чением стабильности белковых молекул в мембране. В качестве наиболее распространенного примера гликопротеи- нов обычно приводят иммуноглобулины крови, но это не мембран- ные гликопротеины. Типичным примером гликоконъюгатов, вы- полняющих свои функции в составе мембран, являются антиген- 57 ные детерминанты эритроцитов различных групп крови. Они пред- ставлены как гликолипидами, так и гликопротеинами, в числе ко- торых – белок гликофорин. Очень важна роль углеводного компонента белковых моле- кул в формировании специфических функций мембранных белков и липидов. Многие белковые молекулы, особенно био- логически активные вещества (например, нейропептиды), син- тезируются в виде крупных, неактивных предшественников, которые затем расщепляются специфическими протеазами с формированием «зрелых» биологически активных продуктов. Деятельность протеаз контролируется уровнем гликозилирова- ния белков. Так, многие белки, синтезируемые вначале как гликопротеины, в дальнейшем в результате процессинга теря- ют олигосахаридную часть. 4.4. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ – ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ Если липиды – относительно низкомолекулярые соединения с молекулярным весом около 1000 дальтон (1 килодальтон, кДа), то белки относятся к высокомолекулярным соединениям. Их молеку- лярный вес достигает 1000 кДа и более. Белковые цепи состоят из различных аминокислот, имею- щих или гидрофильную, или гидрофобную природу. Белковая цепь включает сотни аминокислотных остатков. Отдельные белки различаются между собой не только по числу аминокис- лотных остатков, но и по их структуре и по порядку следова- ния друг за другом. Физико-химические и биологические свой- ства белка определяются именно последовательностью амино- кислотных остатков в ее цепи, то есть своей первичной струк- турой. В растворе белковая цепь не имеет форму вытянутой нити, а частично образуют α-спираль. Между -С=О и -NН группами, если они достаточно близко подходят друг к другу, возникают водородные связи, которые придают устойчивость спиральным участкам: -С=О….Н-N-. Протяженность спираль- ных участков определяется включением в белковую цепь ами- нокислоты пролина, в этом участке образуются изгибы. 58 Некоторые аминокислоты плохо укладываются в спирали и возникает так называемая β-складчатая структура. Кроме того, остатки цистеина, даже расположенные на большом расстоя- нии друг от друга, могут сшиваться между собой ковалентны- ми S–S связями. В результате белковая молекула сворачивает- ся в компактную глобулу. Глобулярная структура характерна для белков, функционирующих в гидрофильной среде (в цито- плазме). Имеются и белки, которые в силу особенностей ами- нокислотного состава (в частности, низкого содержания про- лина) принимают форму длинных фибрилл (фибриллярные белки). Поскольку функции белков определяются особенностями их струк- туры и упаковки, ученые обращают особое внимание на это обстоя- тельство. Различают несколько видов белковых структур, различаю- щихся по сложности. Последовательность аминокислот называют пер- вичной структурой, поскольку именно она во многом определяет свой- ства белковой молекулы. По-видимому, именно в первичной структуре «записана» информация о том, какая будет вторичная структура белка, составленная из α-спиралей и β-складок. Белковые глобулы рассматри- вают как пример третичной структуры – на ее уровне формируется специфическая ферментативная, рецепторная и другие виды активно- сти белковой молекулы. При ассоциации нескольких глобул опреде- ленным образом между собой образуется четвертичная структура, при- обретающая способность тонкой регуляции белковых функций. Как происходит образование белковых ассоциатов при формировании чет- вертичной структуры? Если полярных участков в молекуле белка недостаточно для то- го, чтобы изолировать гидрофобные участки глобулы от соприкос- новения с водой, то часть из них окажется на поверхности. Для то- го, чтобы уменьшить невыгодные контакты с водой, гидрофобные белки образуют ассоциаты, состоящие из нескольких субъединиц. Именно такое строение имеет подавляющее число мембранных белков, поэтому можно предположить, что в их составе преоб- ладают аминокислоты с неполярными радикалами. Для ряда мем- бранных белков это действительно справедливо. 59 Рис. 24. Структура гликопротеина Молекула гликопротеина состоит из белкового остова, к которому присоединены сахарные цепочки. Длина и состав цепочек могут варьировать. Заштрихованными фигурами обозначены радикалы аминокислот. Важный белковый компонент мембраны – гликопротеины – белковые молекулы, содержащие углеводные цепочки (рис. 24). Периферические белки или домены интегральных белков, распо- ложенные на наружной поверхности мембраны, почти всегда гли- козилированы. Углеводные цепочки гликопротеинов имеют разнообразную структуру. Роль гликопротеинов в жизни клетки многообразна. Некоторые из них играют роль ферментов, другие обладают гор- мональной активностью. Предполагают, что одна из функций про- цесса гликозилирования – обеспечить возможность белкам, синте- зированным в аппарате Гольджи, транспорта через клеточ- ную мембрану. Гликопротеины, расположенные на поверхности 60 клеток, ответственны за такие важные процессы, как взаимное рас- познавание клеток – с их помощью клетки многоклеточного орга- низма устанавливают межклеточные контакты. Они, по-видимому, также служат материалом, склеивающим клетки одного типа меж- ду собой. Предполагают также, что от структуры гликопротеинов зависят устойчивость и многие другие свойства клеточной поверх- ности. Гликозилированные белки обладают резистентностью к протеолизу и поэтому имеют большую длительность жизни. Гли- копротеины, находящиеся на поверхности эритроцитов, определя- ют группу крови. 4.4.1. ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ПОДВИЖНОСТЬ БЕЛКОВ В БИСЛОЕ Мембраны содержат от 20 до 80% белка (по весу). При этом в разных мембранах количество белков существенно различается. Так, в мембранах митохондрий на долю белков приходится около 75%, а в плазматической мембране клеток миелиновой оболочки – около 25%. Так как липидные молекулы имеют небольшой размер (5 Å) и невысокую молекулярную массу, их число в 50 раз больше числа белковых молекул. Поэтому белковые молекулы как бы вкраплены в липидный бислой мембраны. Белки различаются по своему положению в мембране (рис. 25). Молекулы белков могут глубоко проникать в липидный бислой и пронизывать его (интегральные белки), либо прикрепляться к мем- бране разными способами (периферические белки). Перифериче- ские белки отличаются от интегральных меньшей глубиной про- никновения в бислой и более слабыми белок-липидными взаимо- действиями (то есть меньшей зависимостью от бислоя). Перифери- ческие белки могут обратимо менять свой статус, прикрепляясь к мембране на определенное время (такие белки называют амфипа- тическими). Прикрепляясь к мембране, они взаимодействуют либо с интегральными белками, либо с поверхностными участками ли- пидного бислоя, приобретая новые свойства. Деление мембранных белков на периферические и интегральные определяется их струк- турой, количеством гидрофобных аминокислот и их расположени- ем в первичной структуре, то есть всеми теми свойствами, которые обеспечивают взаимодействие белка с бислоем. Для амфипатиче- 61 ских белков имеются специальные сигналы, стимулирующие их ассоциацию с мембраной (часто таким сигналом является их фос- форилирование специфическими киназами, изменяющее их тре- тичную структуру и гидрофобность, точнее – лиотропность). К та- ким белкам, например, относят протеинкиназу С, факторы сверты- вания крови. Белки, образующие комплексы с интегральными белками (к ним относится ряд пищеварительных ферментов, участвующих в гидролизе крахмала и белков), прикрепляются к интегральным белкам мембран микроворсинок кишечника. Примерами таких комплексов могут быть сахараза-изомальтаза и мальтаза-гликоа- милаза. Полярные или заряженные домены белковой молекулы могут взаимодействовать с полярными «головами» липидов, обра- зуя ионные и водородные связи. Рис. 25. Локализация белков в мембранах Трансмембранные белки: 1 – гликофорин, 2 – рецептор адреналина. Поверхностные белки: 3 – белки, связанные с интегральными белками (сукцинатдегидрогеназа); 4 – белки, присоединенные к полярным «головкам» липидного слоя (протеинкиназа С); 5 – белки, «заякоренные» в мембране с помощью короткого гидрофобного концевого домена (цитохром b5); 6 – белки «заякоренные» в мембране за счет жирнокислотного радикала, ковалентно присоединенного к белковой молекуле (G-белок). 62 Интересный пример регу- лируемого взаимодействия с мембраной был обнаружен при изучении аминокислот- ной последовательности ин- тактной формы микросомно- го цитохрома b5 (рис. 25). Этот белок участвует в раз- личных окислительно-восста- новительных реакциях в ка- честве переносчика электро- нов. Его относительно корот- кий участок пептидной цепи вблизи карбоксильного конца состоит сплошь из гидрофоб- ных аминокислот. Если «гид- рофобный якорь» удалить с помощью протеолиза, гем- связывающий домен теряет связь с мембраной и высвобождается в среду. Локализованный в мембране гидрофобный домен или «якорь» является еще одним характерным элементом структуры мембран- ных белков. С помощью такой структуры происходит закрепление периферических белков в мембране. Согласно классификации, интегральные белки пронизывают липидный бислой. Размер интегральных мембранных белков в среднем составляет 80 Å, но встречаются и более крупные белки – до 350 Å величиной (белок тилакоидов хлоропластов). Обычно эти белки обладают выраженной асимметрией и, соответственно, асимметрично расположены в мембране (рис. 25). Некоторые из трансмембранных белков пронизывают мембрану один раз (гликофорин) – битопические, другие имеют несколько участков (доменов), последовательно пересекающих бислой – по- литопические (рис. 26). Монотопические белки относятся к пери- ферическим белкам (рис. 25). Рис. 26. Монотопическая (А), битопическая (Б) и поли- топическая (В) локализация белков в мембране 63 Рассмотрим битопический белок – гликофорин из мембраны эритроцитов. В его аминокислотной последовательности был об- наружен короткий участок, состоящий из 23 неполярных амино- кислот, расположенный примерно в середине цепи. Исследования показали, что молекула гликофорина полностью пронизывает мем- брану, причем погруженный в мембрану гидрофобный участок имеет α-спиральную структуру. Примером политопических белков являются транспортные АТФазы, бактериородопсин. Для бактериородопсина из мем- браны Halobacterium halobium по данным рентгеноструктурно- го исследования фотосинтетических реакционных центров бак- терий было показано, что его молекула содержит несколько α-спиральных участков, последовательно пересекающих бис- лой (рис. 27). Многие мембранные белки состоят из двух частей: из участков, богатых полярными аминокислотами, и участков, обогащенных неполярными аминокислотами. Эти белки упакованы в мембран- ный бислой так, что их неполярные участки контактируют с гидро- фобными участками бислоя. Рис. 27. Интегральные белки мембран, содержащие от 1 до 12 трансмембранных доменов 64 Анализ аминокислот некоторых мембранных белков показал, что они содержат примерно столько же полярных аминокислот, сколько и обычные водорастворимые белки, тем не менее в воде они растворяются очень плохо. Причина их гидрофобности кроет- ся не в самом аминокислотном составе, а в порядке чередования аминокислотных остатков – гидрофобные аминокислотные ради- калы не рассеяны вдоль по полипептидной цепи, а сконцентриро- ваны в гидрофобные домены. Некоторые мембранные белки увеличивают свою гидрофоб- ность с помощью ковалентной связи с липидными компонентами мембран. Эти белки используют для более прочного контакта с бислоем миристиновую С14:0 или пальмитиновую С16:0 жирные ки- слоты или гликозилфосфатидилинозитол. Белки, связанные с жир- ными кислотами, локализованы, в основном, на цитоплазматиче- ской поверхности плазматической мембраны, а белки, связанные с гликозилфосфатидилинозитолом – на наружной. В структуре многих мембранных белков, как правило, четко различаются участки, ответственные за их биологическую актив- ность. Очень часто биологически активный участок состо