Иммобилизованные ферменты
Источники ферментов. Преимущества иммобилизованных ферментов
Ферменты и ферментные системы применяются в медицине, сельском хозяйстве, органическом синтезе, химическом анализе, в различных отраслях промышленности (пищевая, фармацевтическая, текстильная, кожевенная и др.). Ферменты получают из растительных и животных тканей или путем микробного синтеза.
Ферменты животного происхождения:
· лактатдегидрогеназа – сердце крупного рогатого скота;
· каталаза – печень КРС, свиньи;
· сычужный фермент – сычуг молочных телят и ягнят;
· щелочная фосфатаза – кишечник КРС;
· гиалуронидаза – семенники КРС;
· фумараза, трансаминаза – сердце свиньи;
· трипсин, химотрипсин, карбоксипептидаза, эластаза – поджелудочная железа свиньи;
· пепсин – желудок свиньи;
· люцифераза – мышечная ткань светляков;
· ацетилхолинэстераза – мышечная ткань электрического угря.
Ферменты растительного происхождения:
· амилазы – ячмень;
· протеазы (папаин – дынное дерево; фицин – фиговое дерево; бромелин – ананас);
· кислая фосфатаза – картофель;
· пероксидаза – хрен;
· уреаза – канавалия мечевидная.
Получение ферментов из растительного и животного сырья имеет ряд недостатков. Так, для растений характерна сезонность, а содержание ферментов в них низкое. Выделение ферментов из животного сырья следует извлекать сразу на мясокомбинатах или возникает проблема его консервации и хранения.
Менее проблематично получение ферментов микробным синтезом. Методами генетической инженерии можно не только целенаправленно увеличить выход фермента, но и получить биообъект, который продуцирует ферменты с улучшенными свойствами (термостабильные, осмоустойчивые, кислото- и щелочеустойчивые и др.). Многие микроорганизмы выделяют ферменты в питательную среду, это облегчает их выделение. В настоящее время налажено крупномасштабное микробиологическое производство следующих ферментов путем (протеаза, α-амилаза, глюкоамилаза, глюкоизомераза и пектиназа).
Однако применение нативных ферментов ограничено по следующим причинам: неустойчивость при хранении и различных воздействиях; сложность их отделения от реагентов и продуктов реакции.
Более перспективно использование иммобилизованных ферментов (от лат. immobilis – неподвижный). Это ферменты, адсорбированные различными физико-химическими методами на твердых носителях или связанные с ними химическими связями. Так, в 1916 г. Нельсон и Гриффин показали, что адсорбированная на угле инвертаза сохраняет каталитическую активность. В 1939 г. был получен первый патент на применение абсорбированных на опилках протеолитических ферментов для обработки шкур. Термин «иммобилизованный фермент» узаконен в 1971 г.
Особенности и преимущества иммобилизованных ферментов:
1. Фермент легко отделить от реакционной среды. Это позволяет остановить реакцию в нужный момент; использовать катализатор повторно; получить продукт не загрязненный ферментом;
2. Процесс можно проводить непрерывно. При этом можно регулировать скорость катализируемой реакции и выход целевого продукта;
3. Путем иммобилизации можно направленно изменить свойства катализатора (специфичность, зависимость от рН и ионного состава среды, действия денатурирующих агентов);
4. Путем иммобилизации можно регулировать каталитическую активность ферментов (путем изменения свойств носителя).
Кинетика ферментативных реакций с использованием иммобилизовнных ферментов зависит от: концентрации субстрата; температуры; концентрации иммобилизованного фермента; степени измельчения частиц с иммобилизованным ферментом; скорости перемешивания; ингибирующего или активирующего действия полимерного носителя; рН и т.д.
Иммобилизованные ферменты и клетки применяются для производства глюкозо-фруктозных сиропов, L-аминокислот, L-яблочной кислоты, безлактозного молока, сахаров из молочной сыворотки, 6-аминопенициллановой кислоты и др.
Технология применения иммобилизованных ферментов и биокаталитических систем экономически эффективна. Так, получение фруктозы из глюкозы с применением иммобилизованной глюкоизомеразы стало дешевле почти вдвое.
Характеристика носителей для иммобилизации ферментов
Требования, предъявляемые к носителям:
1. Высокая химическая и биологическая стойкость, механическая прочность и гидрофильность;
2. Достаточная проницаемость для ферментов и субстратов, большая удельная поверхность, высокая вместимость и пористость;
3. Должны иметь удобные технологические формы (гранулы, мембраны, трубы, листья, волокна и др.);
4. Должны легко переводиться в реакционно-способную форму;
5. Низкая стоимость.
Носители могут быть органическими и неорганическими.
Органические носители
Природные полимерные носители:
· Полисахаридные носители
- целлюлоза – обладает хорошей гидрофильностью, содержит много гидроксильных групп, легко гранулируется, но неустойчива к действию сильных кислот, щелочей и окислителей;
- декстран – разветвленный полисахарид бактерий, состоит из остатков глюкозы. Гели на основе декстрана, сшитые эпихлоргидрином, выпускаются в Швеции под названием сефадекс, а в Венгрии – молселект. При высушивании сефадексы легко сжимаются, а в водных растворах сильно набухают;
- агароза и ее модификации (сефароза, биогель А);
- хитин, крахмал и губчатый крахмал, агар, каррагинан, альгиновые кислоты и их соли, гепарин и др.
· Белковые носители – кератин, фиброин, коллаген, миозин, сывороточный альбумин, желатин.
· Липидные носители – применяются в виде монослоев или бислоев. Монослои сорбируют белковые молекулы. Липидный монослой может на твердую подложку (силикагель, сажу, аэросил – коллоидный SiO2) с последующей сорбцией белка из водного раствора. Для иммобилизации используют также липосомы, получаемые из различных фосфолипидов. К синтетическим аналогам липидов относятся поверхностно-активные вещества (ПАВ). При этом полярные головки ПАВ образуют ядро мицеллы, куда можно включить любое гидрофильное вещество, а углеводородные остатки этих молекул направлены в сторону органического растворителя.
Синтетические полимерные носители:
- полимеры на основе стирола (дауэкс и амберлит). Они подобны стеклам, имеют стабильную структуру пор, не набухают в воде, обладают высокой механической прочностью;
- носители на основе производных акриловой кислоты (акриламид). Клетки различного типа успешно иммобилизуются в полиакриламидном геле (ПААГ).
Функциональные группы полимерных носителей следует либо активировать, либо вводить дополнительные заместители. Так, при активации гидроксильных или аминогрупп на поверхности носителя образуют электрофильные группы, которые обладают высокой реакционной способностью по отношению к нуклеофильным группам на белке (ферменте). Например, амидокарбонаты:
Различными способами в носитель вводят аминогруппы.
Неорганические носители – силикагель, глины, керамика, природные минералы, графитированная сажа, металлы и их оксиды. Их применяют в виде шариков, монолитов, порошка. Они могут быть пористыми и без пор. Преимущества: легкость регенерации; возможность придания любой конфигурации. Для активации их покрывают пленкой оксида металла (алюминия, циркония, титана), полимерами (полиэтиленимин) или обрабатывают солями переходных металлов.