Выбор и обоснование технологической схемы
Существуют два способа промышленного получения лизина с помощью микроорганизмов: двухступенчатый и одноступенчатый.
Двухступенчатый способ предусматривает использование в качестве основного сырья предшественников L -лизина, полученных химическим или биологическим методом. Химическое или биологическое получение и подготовка предшественника в этом способе является первой ступенью производства. Сюда же входит подготовка ферментного препарата, с помощью которого будет происходить трансформация предшественника в L -лизин. Для этого выращивается соответствующий продуцент ферментов, вернее, получается биомасса микроорганизма, обладающая требуемым комплексом ферментов. Биомасса отделяется от культуральной жидкости и используется либо непосредственно для трансформации, либо клетки предварительно разрушаются.
Второй стадией этого способа является трансформация предшественника с помощью ферментов, заключенных в биомассе микроорганизма, в L -лизин. В качестве продуцентов нужного комплекса ферментов используются E.coli, Аrthrobacter, Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum и др.
Одноступенчатый способ получения L -лизина микробиологическим путем представляет собой выращивание на специально подобранной среде микроорганизма, обладающего способностью к сверхсинтезу L -лизина, т.е. ауксотрофного мутанта с нарушенным синтезом гомосериндегидрогеназы, способного образовывать L -лизин свыше 40 г/л.
Для промышленного получения L -лизина можно также использовать мутанты с нарушенным синтезом гомосеринкиназы, первого фермента треониновой ветви биосинтеза, которые образуют лизина до 15-26 г/л.
Большинство продуцентов лизина обладают чрезвычайно неустойчивым аминокислотным обменом, подверженным воздействию внешних условий: состава питательной среды, количества растворенного в среде кислорода, температуры, pH среды, длительности культивирования, количества посевного материала и т. д.
Продуценты лизина являются ауксотрофными мутантами с нарушенным биосинтезом ряда аминокислот. Поэтому для обеспечения нормального развития микроорганизмов требуется введение в состав среды биотина и гомосерина. Гомосерин, по данным многих авторов, может быть заменен суммой двух аминокислот — треонином и метионином. Но концентрация треонина в составе среды должна быть точно регламентирована: введение очень малого количества треонина будет тормозить рост микроорганизма, а избыток повлечет за собой снижение продуктивности мик-
роорганизма по лизину. Экспериментально установлено, что наиболее приемлемой концентрацией L -треонина для различных мутантов является 0,2-0,8мг/мл.
Все продуценты лизина являются биотинзависимыми микроорганизмами. Количество биотина в среде должно быть сравнительно высоким, обычно значительно выше(20мкг/л), чем это необходимо для нормального роста и развития микробной клетки(4-5мкг/л). Если же снизить количество биотина до 1-2 мкг/л, биосинтез лизина снижается в 20-30 раз, но одновременно резко повышается биосинтез глутаминовой кислоты. В культуральной жидкости ее накапливается до 20-30 г/л. Высокая концентрация биотина в среде способствует образованию цитоплазматической мембраны, легко проницаемой для основных аминокислот, таких как лизин, и трудно проницаемой для кислых и нейтральных аминокислот. В результате в такой культуре создаются благоприятные условия для образования повышенного количества внеклеточного лизина за счет высокой концентрации внутриклеточной глутаминовой кислоты, которая является необходимым поставщиком аминных групп при образовании аспарагиновой кислоты и в ряде других превращений цепи образования L -лизина.
Помимо гомосерина, треонина и биотина продуценты лизина, относящиеся к роду Brevibacterium, требуют в питательной среде обязательного присутствия витамина B1(тиамина). Если в среде отсутствует тиамин, то культура плохо растет и вместо L -лизина преимущественно образуется L -аланин. Источниками биотина и тиамина в промышленных питательных средах обычно являются кукурузный экстракт и свекловичная меласса.
В промышленные среды обычно не добавляют чистые аминокислоты. Их содержание в питательной среде пополняется за счет введения богатых аминокислотами отходов различных производств, а также гидролизатов белоксодержащего сырья: кукурузный и рыбный экстракты; гидролизаты шротов, остающихся после извлечения жиров из арахиса, сои, подсолнечника; гидролизаты отходов молочной промышленности, содержащих казеин, рыбной муки, кормовых дрожжей. Дозировка этого сырья определяется, исходя из содержания необходимых для биосинтеза лизина аминокислот.
Для нормального роста, развития культуры и биосинтеза ею L -лизина необходимо в состав среды вводить источники углерода. Хорошими источниками углерода являются моно- и дисахариды: глюкоза, фруктоза, сахароза и мальтоза.
Концентрация углевода в среде существенно сказывается на биосинтезе L -лизина. С увеличением его концентрации количество лизина в среде возрастает, но не всегда это экономически целесообразно, так как с повышением концентрации, например, сахарозы в среде степень его использования микроорганизмом падает. Считается, что процесс с наибольшим экономическим эффектом идет, если концентрация усваиваемого углевода находится в пределах 10-12%. Условия биосинтеза улучшаются, если углеводы вводятся дробно, по мере их потребления из среды.
В промышленных условиях в качестве источника углеводов применяют свекловичную или тростниковою мелассу, гидрол (отходы при производстве сахара), различные гидролизаты целлюлозосодержащего сырья (хлопковой шелухи, древесины, кукурузной кочерыжки), а также гидролизаты крахмала. Наилучшие результаты получаются при выращивании продуцентов лизина на мелассе, которая вносится в состав среды в количестве 15-20%. Недостатком данного сырья являются большие различия от партии к партии, которые могут приводить к существенному снижению выхода лизина. В среднем выход лизина на мелассах составляет 25% от введенного в процесс сахара, а для некоторых мутантов он может достигать 30-33%.
Возможным является использование в качестве источника углерода нормальных углеводородов (газообразные, жидкие и твердые) и производных природного газа этилена (уксусная кислота, этанол и этиленгликоль). При таком источнике углерода используются гомосериновые и треониновые мутанты специальных видов микроорганизмов, усваивающих углеводороды. Углеводороды могут быть использованы в качестве единственного источника углерода или же в сочетании с углеводами или с окисленными формами углеводородов. Считается, что самым перспективным является ацетат, на котором большинство известных продуцентов, а также ряд специальных видов микроорганизмов хорошо растут и образуют лизина до 20-90г/л.
При использовании сред с ацетатом снижается потребность микроорганизмов в биотине до 1мкг на 1 л питательной среды. Но при выращивании на ацетатных средах есть некоторые сложности. Ацетат угнетает биосинтез ферментов цикла трикарбоновых кислот, и потому его повышенное содержание в среде вызывает снижение лизинообразования у микроорганизмов. Предельно допустимое содержание ацетата в среде не превышает 2%. Поэтому при культивировании необходимо осуществлять дробную подачу уксусной кислоты или ее солей. Часто используют смесь кислоты и ацетата натрия или кислоты и ацетата аммония в определенных соотношениях, устанавливаемых для каждого штамма экспериментально, но при всех условиях концентрация ионов ацетата в пересчете на уксусную кислоту не должна превышать 1,5-2,0%. Введение в среду небольшого количества сахара, например глюкозы 1-6% (к ацетату), способствует повышению выхода лизина на 30-50%. Выход лизина в пересчете на потребленный ацетат составляет 25-27%. На этой среде также требуется соблюдение определенного соотношения дефицитных аминокислот.
Таким образом, в зависимости от используемого продуцента могут применяться в промышленных условиях самые разные источники углерода: моно- и дисахариды, гидролизаты полисахаридов, различные углеводороды и некоторые их окисленные формы. Количество источника углерода, технология его внесения в среду и степень его использования на биосинтез лизина зависят от физиологических особенностей данного продуцента и от адаптации его к данному субстрату.
Источник азота обычно вносят в состав среды либо в виде солей аммония, или в виде мочевины. Однако для каждого промышленного штамма преимущества той или иной соли определяются экспериментально. Многие продуценты лизина обладают уреазной активностью и потому могут использовать мочевину в качестве источника аммонийного азота.
Большое значение имеет также соотношение углерода и азота в среде. Оптимальное соотношение для каждого штамма — свое, и отклонение от него приводит к нарушению биосинтеза лизина. В питательной среде источниками азота могут быть аминокислоты, мочевина или соли аммония.
Для продуцентов лизина необходимо в состав среды вводить фосфор в виде калиевых солей фосфорной кислоты, но количество фосфора в среде должно быть регламентировано(8-20 мг%), 10-кратное повышение его концентрации приводит для Coryn. glutamicum к снижению синтеза лизина почти на половину, поэтому фосфорнокислый аммоний нельзя использовать в качестве источника азота. Продуценты лизина испытывают потребность в ряде макро- и микроэлементов: магнии, железе, меди, марганце. Магний вводится в виде соли серной кислоты в количестве от 0,03 до 0,05%, остальные соли вносят в среду также в виде сульфатов, но их количество значительно меньше — (0,0008 - 0,001) %. Обычно железо, медь и марганец специально в среды не вносят, они есть в достаточных количествах в кукурузном экстракте, мелассе и других компонентах среды.
Условия культивирования определяются pH среды, степенью аэрации среды, длительностью и температурой ферментации, возрастом и дозой посевного материала. Все эти факторы оказывают существенное влияние на биосинтез лизина.
Большинство продуцентов лизина являются мезофильными микроорганизмами, имеющими оптимум роста, развития и биосинтеза лизина при температуре 28-30˚C. Отклонения от этой температуры нежелательны. Повышение температуры на 5-7˚C от оптимальной приводит к быстрому автолизу культуры, и в среде накапливается значительно меньше лизина. Понижение температуры на 4-6˚C также невыгодно, так как культивирование резко затягивается на 12-20 ч, хотя выход лизина при этом почти не падает.
Уровень pH среды — это очень ответственный параметр процесса. Как известно, продуцентами являются бактериальные штаммы, и потому в большинстве случаев оптимум pH для культивирования лежит в области, близкой к нейтральной или слабощелочной. Наилучшие результаты по биосинтезу лизина получаются, если pH среды поддерживается около 7,2±0,2, а для Brevibacterium 22 и Brevibacteriumflavum — в интервале 7-7,6. Для всех известных продуцентов лизина pH, обеспечивающий максимальное накопление лизина и рост культуры, лежит в пределах 6-8,5.
Снабжение растущей культуры кислородом является ответственным и важным фактором, влияющим на рост микроорганизма и образование им лизина. Кислород, используемый бактериальной клеткой, должен быть растворен в питательной среде. Для увеличения растворимости кислорода осуществляют барботирование среды воздухом с одновременным ее перемешиванием. В зависимости от систем и конструкций аэрирующих и перемешивающих устройств количество растворенного кислорода в среде будет различным. Различные продуценты лизина испытывают неодинаковую потребность в кислороде, но, учитывая, что процесс биосинтеза лизина связан с высокой активностью дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот и с активностью ферментов глиоксилатного цикла, все они нуждаются в интенсивной аэрации. Недостаточная аэрация приводит к усилению образования аланина и молочной кислоты за счет снижения выхода лизина, что крайне нежелательно. Но в то же время степень аэрации должна быть вполне определенной, так как интенсивная аэрация приводит к усиленному росту самой культуры, выход же лизина начинает падать так же, как и при недостаточной аэрации.
У продуцентов лизина накопление биомассы и аминокислоты не совпадает по времени: биомасса накапливается в первые 12-18 ч, а целевой продукт — лизин — начинает образовываться лишь тогда, когда рост биомассы замедляется. В период отсутствия биосинтеза лизина клетки продуцента крупные; когда же начинается образование лизина, они заметно уменьшаются. Наиболее характерным признаком начала биосинтеза является почти полное потребление из среды треонина. Длительность культивирования 68-72 ч.