Основные этапы производства лизина микробиологическим путем

В отличие от производства кормовых дрожжей промышленное получение лизина осуществляется в строго асептических условиях, на стерильных питательных средах с использованием чистой культуры продуцента. Принципиальная технологическая последовательность процесса получения лизина следующая: приготовление посевного материала; приготовление и стерилизация питательной среды, всей аппаратуры и коммуникаций; культивирование в промышленных ферментаторах; выделение целевого продукта.

1.1.2.1 Приготовление посевного материала

Посевная культура продуцента может быть приготовлена двумя способами: периодически и непрерывно. Приготовление посевной культуры преимущественно ведется периодическим методом.

Свободная от фага и посторонней микрофлоры исходная культура продуцента с чашек Петри с агаром Хоттингера пересевается в пробирки с 2 %-ным мясопентоновым агаром и выращивается в течение суток при температуре 29-30 ^○С. На основе этой культуры готовят на стерильной водопроводной воде суспензию плотностью 10⁸ клеток на 1 мл (ориентировочно 8-10 мл воды на 1 пробирку). Этой суспензией засевают стерильную питательную среду в качалочных колбах. Для получения посевного материала используют среды различного состава, чаще всего в среду входят меласса (3-5 %), кукурузный экстракт (2,5-3,0 %) и поваренная соль (до 0,4 %). Среда подтитровывается 20 %-ным раствором едкого натра до величины рН 7-7,2. В качалочные колбы объемом 750 мл заливают по 100-200 мл среды и стерилизуют в автоклаве. После охлаждения среда в каждой колбе засевается 2 мл посевной суспензии и культура выращивается в течение суток на качалках (180-200 об/мин) при температуре 29-30^○С — это так называемые маточные посевные колбы. Затем производится засев посевных колб со средой такого же состава, засев осуществляется из расчета 5 % из маточной односуточной культуры. Посевные колбы также выращиваются на качалках сутки при температуре 30 ^○С. Посевными колбами засевается первый инокулятор из расчета 0,05-0,1 % по объему, где культура выращивается сутки при аэрации и перемешивании при 29-30 ^○С. В инокуляторе состав среды может быть таким же или другим, более близким к производственной питательной среде. Состав среды для каждого продуцента устанавливается экспериментально.

Посевная среда обычно стерилизуется в посевном аппарате. Если производственные ферментаторы очень большой емкости или производительность завода велика, то может быть еще одна ступень инокуляторов, объемы которых больше предыдущих, так как количество задаваемой в аппарат посевной культуры сравнительно высоко — от 1 до 5% по объему, а для ряда продуцентов может быть 20-30%. Следует помнить, что при периодическом способе получения посевной культуры независимо от количества стадий длительность выращивания продуцента на каждой стадии будет 16-24ч.

Инокуляторы или посевные ферментаторы имеют сравнительно простые конструкции. Главное требование — это минимальное количество штуцеров, смотровых окон, люков, отсутствие вращающихся деталей, надежные устройства для герметизации ферментатора. Готовая посевная культура независимо от способа ее выращивания должна быть свободна от фага, посторонней микрофлоры и иметь титр около 10⁹ клеток на 1 мл.

1.1.2.2 Приготовление и стерилизация питательной среды, аппаратов и коммуникаций

Питательная среда для выращивания продуцентов лизина состоит из уксусной кислоты, кукурузного экстракта или другого источника ростовых веществ, аммиачной воды и пеногасителя. Питательная среда готовится и стерилизуется в две стадии с учетом свойств компонентов, входящих в ее состав. Стадия подготовки и стерилизации среды состоит из смешивания компонентов питательной среды в определенной пропорции с помощью специальных дозаторов в реакторе, растворения солей при перемешивании, нагрева до температуры стерилизации, выдержки при этой температуре и охлаждение до температуры, при которой проводится культивирование продуцента лизина.

В производстве лизина используется меласса, содержащая термолабильный компонент — сахарозу. Поэтому ее стерилизуют отдельно. В реактор, снабженный мешалкой, подают мелассу и нагревают ее при постоянном размешивании до температуры 80^○С, смешивая ее с водой согласно имеющейся рецептуре, затем ее быстро разогревают до температуры 120-122 ^○С в специальном аппарате и выдерживают при этой температуре определенное время, необходимое для полной гибели всей микрофлоры. Остальные компоненты среды также в реакторе с перемешиванием смешивают и растворяют в воде с подогревом, нагревают в специальном аппарате до температуры стерилизации, выдерживают при ней и охлаждают. Длительность стерилизации значительно меньше, но температура выше.

Пеногаситель часто стерилизуют отдельно, особенно в том случае, когда им является масло или жир. Режимы стерилизации (температура и длительность) при обработке пеногасителя более жесткие, чем это принято для стерилизации любых питательных сред.

Процесс получения лизина требует строгих асептических условий, и поэтому особое внимание уделяется стерилизации не только среды, но и всех реакторов, коммуникаций, подаваемого воздуха. При стерилизации аппаратуры режимы стерилизации зависят главным образом от материала, из которого изготовлены его части. Самая эффективная обработка аппаратуры и коммуникаций — под давлением острым паром при температурах около 135-140 ^○С. Но отдельные блоки аппаратов, в том числе датчики измерительных приборов, не выдерживают таких условий стерилизации, и поэтому в этих случаях могут применяться «холодные» способы стерилизации. Для такой обработки могут быть использованы бактерицидные газы (этилен) и растворы химических реагентов. После «холодной» стерилизации остатки химических реагентов должны быть удалены промывкой стерильной водой.

Степень стерильности среды, оборудования и коммуникаций может быть проверена. Простерилизованную среду или смывы, произведенные стерильной водой с внутренних поверхностей аппаратов и трубопроводов, высевают на агаризованные или жидкие питательные среды и инкубируют в термостате сутки. Если среды остаются стерильными, то стерилизация проведена качественно. Такой анализ проводится при пуске завода, в случае появления инфекции и периодически в профилактических целях.

1.1.2.3Культивирование продуцента в промышленных ферментаторах

Выращивание производственной культуры продуцента лизина осуществляется в подавляющем большинстве случаев периодическим способом в ферментаторах. В отличие от аппаратов, используемых при производстве кормовых дрожжей, эти реакторы сравнительно меньших габаритов и имеют объемы 50, 63 и 100 м³. Они все предназначены для выращивания культуры в асептических условиях со строгим соблюдением герметизации процесса. Ферментаторы снабжены необходимыми коммуникациями, системой подачи стерильного пеногасителя, охлаждающими устройствами и устройствами для перемешивания и введения в питательную среду стерильного воздуха, дополнительных питательных ингредиентов, а также растворов кислот и щелочей для поддержания pH среды на заданном уровне.

Стерильная среда в ферментатор может вводиться при температуре, близкой к температуре выращивания продуцента (32-35 ^○С), или с температурой около 80^○С. В этом случае для окончательного охлаждения аппарата и среды используются теплообменные устройства самого ферментатора.

Когда температура среды достигает оптимальной, из посевного ферментатора вводят посевной материал и тут же начинают аэрировать содержимое ферментатора. Коэффициент заполнения аппарата 0,65-0,75 в зависимости от степени пенообразования в данных условиях культивирования.

В ферментаторе устанавливают определенный режим культивирования в зависимости от особенностей продуцента. Для продуцентов лизина длительность ферментации 58-72 ч.

В первые сутки микроорганизмы ассимилируют приблизительно 25 % от общего азота среды, углеводов и почти все аминокислоты, накапливается почти вся биомасса. Вторая стадия роста культуры сопровождается резким замедлением накопления биомассы и самыми высокими скоростями биосинтеза лизина. Питательная среда очень сильно истощается, изменяется рН среды. В это время целесообразно проводить подтитровывание среды 25 %-ным раствором аммиака или 15 %-ным раствором NaOH с целью стабилизации рН и осуществлять дополнительное введение питательных веществ (подпитка). Последняя стадия выращивания продуцента лизина характеризуется некоторой убылью биомассы за счет небольшого автолиза клеток и резким снижением скорости накопления лизина.

Как уже говорилось выше, на биосинтез лизина существенное влияние оказывают аэрация и перемешивание. Поэтому на всех стадиях процесса все параметры культивирования строго регламентируются и контролируются (температура, рН, изменение основных компонентов среды, накопление лизина, аэрация, перемешивание и т.д.).

При периодическом способе культивирования продуцента через 58-72 ч концентрация лизина в культуральной жидкости достигает 25-40 г/л, биомассы по сухой массе накапливается 10-15 г/л, экономический коэффициент по потреблению сахара и пересчете на лизин составляет 25-35 %.

Готовая культуральная жидкость помимо лизина содержит биомассу продуцента, остатки не потребленных питательных веществ среды, продукты обмена веществ.

1.1.2.4 Выделение целевого продукта

На основе культуральной жидкости получают технические препараты в виде жидкого концентрата лизина (ЖКЛ) и сухого кормового концентрата лизина (ККЛ), а также кристаллический лизин.

Для кормовых целей целесообразнее получать технические препараты ЖКЛ и ККЛ, так как они содержат помимо лизина значительное количество других очень важных для животного организма соединений, в частности витамины: рибофлавин, пантотеновую кислоту, фолевую кислоту, ннкотнпамид и др.

Технические препараты лизина получают на основе всей суммы веществ, присутствующих в культуральной жидкости, включая биомассу продуцента и твердые нерастворимые частицы среды. Так как культуральная жидкость имеет сравнительно низкое содержание сухих веществ (10-13%) и не обладает стабильностью при хранении, поэтому необходимо увеличить концентрацию сухих веществ методом выпаривания или высушивания Готовая культуральная жидкость перед концентрированием должна содержать минимальное количество редуцирующих сахаров, так как они могут образовывать в процессе конценрирования с участием ε-аминогруппы лизина соединения, не усваиваемые животными, т. е. происходит безвозвратная потеря целевого продукта.

Для стабилизации лизина культуральную жидкость подкисляют соляной кислотой до рН 5,0 и добавляют 25%-ный раствор метабисульфита натрия в количестве 0,4%. Далее стабилизированную культуральную жидкость выпаривают в вакуум-выпарной установке до концентрации сухих веществ 35-40%. Потери лизина на этой операции составляют от 5 до 15%. Вязкость ЖКЛ 0.648Х Х10 ' кг/(м-с), замерзает он при — 18°С, удельная масса 1,150-1,300, рН 4,5-6,0.

Жидкий концентрат лизина (ЖКЛ) хорошо сохраняется в течение 3—4 мес. Считается, что он обладает большей биологической ценностью, чем сухой ККЛ.

Патентная проработка

Патентный поиск проведен в направлении современных решений по модернизации используемого оборудования и методов производства L -лизина. Патенты представлены в таблице 1.1.

Таблица 1.1 — Патентный поиск

Продолжение таблицы 1.1

Продолжение таблицы 1.1

Продолжение таблицы 1.1

Продолжение таблицы 1.1