Генетическая инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты.
Следует отметить, что ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности. Это позволяет генной инженерии преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.
Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:
- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);
- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);
- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.
Рестриктазы (рестрицирующие эндонуклеазы, эндонуклеазы рестрикции) - это ферменты, узнающие и атакующие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции).
Системы рестрикции и модификации широко распространены у бактерий; их существование играет важную роль в защите резидентной ДНК от загрязнения последовательностями чужеродного происхождения.
Впервые ДНК-полимераза была выделена Корнбергом с сотрудниками в 1958 году из E. coli. Фермент состоит из мономерной полипептидной цепи с молекулярной массой 103 кДа и имеет 3-х доменную структуру. Каждый домен обладает своей ферментативной активностью: 5’ - 3’ полимеразной (для реакции необходимо наличие одноцепочечной ДНК-матрицы и комплементарного участку этой цепи фрагмента — праймера (затравки) с З'-ОН концом), 3’ - 5’ экзонуклезной (гидролизует одноцепочечную или двухцепочечную ДНК с З'-ОН конца, 3'—5' экзонуклеолитическая активность проявляется в направлении, обратном синтезу ДНК поэтому играет важную роль в точности полимеризации, направляемой матрицей), 5’ - 3’ экзонуклеазной (деградирует одну цепь двухцепочечной ДНК, начиная со свободного 5'-конца, расщепляет диэфирную связь только в спаренных участках двухцепочечной молекулы ДНК, 5'—3' нуклеаза может вырезать с 5'- конца олигонуклеотиды длиной до десяти остатков).
|
|
Такое сочетание ферментативных активностей позволяет ДНК-полимеразе I E. coli играть активную роль в репарации повреждений ДНК in vivo. N - концевой домен соединен с соседним петлей из аминокислотных остатков и легко отделяется с помощью протеолитических ферментов. Оставшаяся часть бифункциональна, так как состоит из полимеразы и 3’ - 5’ экзонуклезы. Она названа фрагментом Кленова (по фамилии одного из авторов, описавших ее). Фрагмент Кленова (Pol IK) обычно используют для достройки одноцепочечных 5'-концов на двухцепочечной ДНК, часто генерируемых рестриктазами, до тупых; для синтеза второй цепи на одноцепочечной ДНК, а также для гидролиза одноцепочечных З'-концов на двухцепочечных молекулах ДНК.
Обратная транскриптаза используется для транскрипции м-РНК в комплементарную цепь ДНК.
Обратная транскриптаза обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями:
1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;
|
|
2) активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК - ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;
3) ДНК-эндонуклеазной активностью.
Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК.
Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК.
Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. coli. Показано, что сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных двухцепочечных молекул кДНК. По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Полученную двухцепочечную кДНК можно затем встраивать в клонирующие векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований.
|
|
Лигазы. В 1961 г. Мезельсон и Вейгл на примере фага l показали, что рекомбинация включает разрыв и последующее воссоединение молекул ДНК. Это положило начало поискам фермента, участвующего в сшивании фрагментов ДНК. В 1967 году такой фермент был найден и получил название ДНК-лигаза. Он катализирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-х цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты.
Иными словами, ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды, образуя связь между остатками сахаров. ДНК-лигазы абсолютно необходимы в процессах репарации ДНК, в процессах репликации - при удвоении цепи ДНК.
В генной инженерии используются 2 типа ДНК-лигаз, отличающихся по потребностям в кофакторах и способу действия. ДНК-лигаза E. coli в качестве кофактора использует дифосфопиридиннуклеотид, а лигаза фага Т4 - АТФ в присутствии Mg2+. Лигаза фага Т4 более универсальна, так как помимо лигирования липких концов способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Она используется чаще.
Терминальная трансфераза, поли-А – полимераза была обнаружена Боллумом в 1962 году в тимусе теленка.
Субстратом терминальной трансферазы при использовании в качестве кофактора ионов Mg2+ является одноцепочечная ДНК с З'-ОН концом или двухцепочечная ДНК с выступающим одноцепочечным З'-ОН концом. Если в качестве кофактора используются Co2+, этот фермент может катализировать присоединение дезоксинуклеотидов к 3’-ОН концу двухцепочечной ДНК с тупыми концами.
При введении в реакцию, направляемую терминальной трансферазой, лишь одного типа дезоксинуклеотидов образуются молекулы ДНК, имеющие гомополимерные 1-цепочечные 3'-концы. Таким же образом можно достроить другим молекулам ДНК гомополимерные 3'-концы, комплементарные первым. Смешение полученных препаратов ДНК при определенных условиях может приводить к формированию гибридных молекул ДНК.
Именно с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы в 1972 г. был выполнен первый эксперимент по рекомбинации молекул ДНК in vitro.
Поли (А) - полимераза E. coli была открыта Сиппелом в 1973 году. Она катализирует присоединение к 3’-ОН концу одноцепочечных молекул РНК поли (А) последовательностей. Применяется при подготовке молекул РНК к копированию с них комплементарной ДНК для введения радиоактивной метки в 3’-конец РНК.
2-м этапом работы в области генетической инженерии является внедрение гена в генетический элемент (вектор), который обладает способностью к репликации.
Ген, полученный тем или иным способом, содержит информацию о структуре белка, но сам по себе не может реализовывать эту информацию. Для этого нужны дополнительные механизмы, которые управляют действием гена, поэтому перенос генетической информации в клетку осуществляется в составе векторов. Векторы – это, как правило, кольцевые молекулы ДНК, которым свойственно самостоятельно реплицироваться. Ген вместе с вектором составляет рекомбинантную ДНК.
Конструирование рекомбинантных ДНК мы рассматривали чуть выше при изучении обратной транскриптазы.
Различают два основных класса векторов:
- вирусы
- плазмиды.
Большое значение для биотехнологии имеет способность вирусов к быстрой транспортировке из клетки в клетку, распространяясь в растительных или животных тканях так, что в кратчайшие сроки развивается генерализованная инфекция по всему организму. Такое свойство вирусов дает возможность генетической модификации соматических клеток взрослого организма. В этом плане открываются перспективы лечения наследственных заболеваний человека путем введения вирусов, которые разносят отсутствующие гены во все клетки людского тела.
Плазмиды – автономные, способные к саморепликации генетические единицы. Наиболее используемыми плазмидными векторами для клонирования являются плазмиды E. coli.
3) Введение гена, который входит в состав вектора в организм-реципиент. Передача генов, встроенных в плазмиду осуществляется путем трансформации или конъюгации.
Трансформация – это перенос свободной ДНК, в том числе и плазмидной, в клетку-реципиент, что вызывает смену свойств клетки. При этом происходит рекомбинация и интеграция одноцепочечного фрагмента ДНК в хромосому реципиента или какую-нибудь внехромосомную генетическую единицу. Трансформация является наиболее универсальным путем передачи генетической информации и имеет наибольшее значение для генетической инженерии.
Конъюгация – один из способов обмена генетического материала, при котором происходит направленный перенос генетической информации от донора к реципиенту. Такой путь переноса находится под контролем особенных конъюгативных плазмид (фактор фертильности). Перенос информации от донорской клетки к реципиентной осуществляется через специальные половые ворсинки. Путем конъюгации происходит перенос лишь некоторых плазмид (конъюгативных).