• Главная
• Избранное
• Популярное
• Новые добавления
• Случайная статья

Бактерии вырастут до нужной плотности

• смешать все компоненты, кроме MnCl₂, довести KOH pH до 6.7(~650 µl 1N на 0.5L TB). Добавить MnCl₂, стерилизовать фильтрацией через 0.45µm фильтр.
• Если вместо PIPES использовать HEPES,то:

Конец формы

Начало формы

SOC, SOB

(хранить при NT).

1. автоклавировать, охладить до <60^oС;
2. добавить:

0.01V 2M Mg²⁺{= 1M MgCl₂+1M MgSO₄}
0.01V 2M glucose;

1. фильтровать через 0.2µm фильтр;
2. аликвотить, хранить при -20^oC, (-70^oC).

SOB получается, если не добавлять глюкозу.

Конец формы

Начало формы

BMeEtOH

0.5M (хранить при +4^oС).

Конец формы

Начало формы

M Mg-solution

(стерилизовать автоклавированием, хранить при NT), p=1.173:

Конец формы

• Источник: H.Inoue, H.Nojima, H.Okayama "High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids", Gene, 96(1990), 23-8.
• В данной методике доля компетентных клеток ~10%.
• Частота трансформации постоянна до ~10ng pDNA/100µl клеток, далее весьма быстро падает.
• Насыщение в районе 100-200ng/100µl клеток.
• >25ng/100µl клеток - с заметной частотой появляются двойные трансформанты.
• В случае большого количества простых трансформаций (например, клонирование плазмид) работу можно значительно ускорить, если (i) брать для трансформации маленький объём клеток (~20µl), (ii) высевать штрихом сразу после теплового шока (без "оживления").
• Мы читали и слышали совершенно разные мнения о требованиях, предъявляемых к качеству DMSO. Поэтому на всякий случай пользуемся "Sigma, #D2650", расфасованным под аргоном (аликвоты в ампулах по 5 или 10ml). Фасуем его один раз и храним фасовки при -70^oС.
• Основные преимущества химически компетентных клеток перед электрокомпетентными:
1. Химически компетентные клетки можно трансформировать неочищенной лигазной смесью (и вообще DNA, находящейся в умеренно солевом буфере). В случае электрокомпетентных - DNA должна быть очищена, т.к.: (i) слишком высокая концентрация соли способна вызвать искровой разряд в ячейке (ii) при электротрансформации в оболочке E. coli появляются дырки, в них может проникнуть фермент, используемый для лигирования.
2. Количество клеток в электрокомпетентной фасовке значительно больше, чем в химически-компетентных, поэтому не стоит пытаться высевать на одну чашку слишком большую долю фасовки. Это чревато подростом (появлением сателлитных колоний) и снижением компетентности.

• Рост при 37^oС приводит к резкой (с острым максимумом) зависимости компетентности от плотности клеток (A₆₀₀=0.45 для DH10B). При 18^oС высокая компетентность достигается в широком интервале A₆₀₀=0.35-0.70.
• Связь концентрации клеток с оптической плотностью: OD₅₅₀=c[cells/ml]*10⁸/k.

П.10.

• PIPES в составе TB можно заменить на HEPES или BES. Это приведёт лишь к небольшому уменьшению компетентности. Эффективность трансформации практически постоянна в диапазоне pH 5.6-7.0, однако при pH>7.0 MnCl₂выпадает в осадок.

П.14.

• DMSO токсичен для бактерий в высокой концентрации (это позволяет не заботится о его стерильности), поэтому он добавляется к клеткам в два этапа. Причем, лучше добавлять так, чтобы не возникало зон "высокой концентрации" (но погружать конец типчика в суспензию клеток нельзя - DMSO замерзнет и закупорит тип). Либо по каплям при постоянном перемешивании, либо нанести на стенки охлажденной пробирки (где DMSO замерзнет), с которых смыть, помешивая пробирку.

П. 17.

• Пробирка должна быть пластиковой, применение стеклянной пробирки может понизить эффективность приблизительно в 10 раз (по видимому, из-за адсорбции DNA на стекло).

П. 18.

• Замораживание в жидком азоте (холодовой шок) повышает компетентность в 4-5 раз.
• Влияние размера плазмиды на эффективность трансформации: молярная частота практически постоянна для размеров ~3-7.5kb;

для 10kb ~ 50%;
для 13kb ~ 27%;
для 17.5kb ~ 15%.

П.24.

• Тепловой шок: температура может быть в интервале 40-50^oС.
• Есть сообщение, что если тепловой шок заменить "замораживанием в жидком азоте (1'), оттаиванием (до NT)", то компетентность повысится в ~10 раз.