Генетическая инженерия и биотехнология
Вертьянов С. Ю.
Генетическая инженерия (ГИ) — совокупность методов, позволяющих искусственно переносить генетическую информацию из одного организма в другой с помощью специально созданных генетических конструкций. Одна из задач ГИ — получение организмов с желаемыми свойствами. Основным подходом ГИ является конструирование in vitro (вне организма) рекомбинантных молекул ДНК (искусственно скомбинированных из фрагментов) с заданными наследственными свойствами, поэтому ГИ также называют технологией рекомбинантных ДНК. Организмы, в которые с помощью методов ГИ введены несвойственные им гены, носят название трансгенных.
Основные принципы ГИ
Бурное развитие ГИ началось после 1970 г., когда из клеток бактерий научились выделять рестриктазы — ферменты, защищающие бактерии от бактериофагов. Узнавая в чужеродной ДНК специфичный для каждой рестриктазы сайт (последовательность из 4—6 нуклеотидов), рестриктазы делают в этом сайте разрывы обеих цепей ДНК. В результате чужеродная ДНК оказывается разрезанной на фрагменты и нефункциональной. На сегодня известно около 3500 рестриктаз. Например, рестриктаза Eco RI ("еко-эр-один") из кишечной палочки (Escherichia coli) узнает сайт ГААТТЦ:
В результате ступенчатого разреза образуются фрагменты ДНК с выступающими однонитевыми концами, комплементарными друг другу. Эти концы могут вновь соединяться, поэтому их называют "липкими концами". Если взять ДНК, например, человека и моркови, обработать одной и той же рестриктазой и смешать, то фрагменты ДНК моркови и человека будут соединяться липкими концами. Но такая связь будет непрочной: водородные связи между всего лишь четырьмя парами оснований могут легко разойтись. Слипшиеся фрагменты ДНК можно зафиксировать, если добавить в раствор ДНК-лигазу (второй по значимости фермент ГИ), сшивающую цепи ДНК, разрезанные рестриктазой. В результате получится стабильная рекомбинантная ДНК.
|
|
Далее необходимо сохранить и размножить полученные рекомбинантные молекулы. С этой целью их встраивают в специальные конструкции, называемые векторными молекулами ДНК, или векторами. Обычно векторы конструируют из бактериальных плазмид. Типичный вектор включает:
1. Сайт узнавания определенной рестриктазой для встраивания в вектор целевой ДНК.
2. Ген устойчивости к одному из антибиотиков для последующего отбора клеток, получивших рекомбинантный вектор.
3. Промотор, обеспечивающий экспрессию целевой ДНК.
Приведем пример использования вектора для получения штамма кишечной палочки, продуцирующей целевой белок. Для встраивания в вектор смесь фрагментов целевой ДНК (с геном, кодирующим целевой белок) и ДНК вектора обрабатывают сначала одной и той же рестриктазой, затем ДНК-лигазой. В результате образуется рекомбинантный вектор. Для размножения его вводят в клетки кишечной палочки или дрожжей. На поверхности твердой питательной среды с антибиотиком каждая клетка, несущая рекомбинантный вектор, размножается и образует колонию из одинаковых клеток — клон. Каждая клетка-родоначальница клона получила одну молекулу рекомбинантного вектора, которая реплицируется и передается всем клеткам колонии. Поэтому такую процедуру называют молекулярным клонированием.
|
|
Первой реакцией научной общественности на создание ГИ-технологии было введение ограничений на эксперименты с рекомбинантными ДНК. Ученые полагали, что объединение генов разных организмов может привести к появлению нового организма с нежелательными или даже опасными свойствами. Прошло несколько лет, и исследователи убедились, что их опасения сильно преувеличены. Микроорганизмы, измененные с помощью генно-инженерных манипуляций, во внешней среде не выдерживают конкуренции, поскольку значительную часть своих ресурсов они затрачивают на синтез целевого белка, в ущерб собственной конкурентоспособности.
Достижения ГИ
С развитием ГИ ученые получили возможность синтезировать, выделять, комбинировать и перемещать гены и любые другие фрагменты ДНК. ГИ внесла революционный вклад в развитие многих биологических дисциплин: молекулярной биологии, микробиологии, вирусологии, цитологии, эмбриологии, медицинской генетики и генетики человека. Появилась ранее недоступная возможность изучения молекулярной организации геномов (в том числе высших эукариот), что привело к возникновению геномики — раздела генетики, изучающего структурную организацию и функционирование геномов.
ГИ-методы позволили реализовать программы секвенирования (определения полных нуклеотидных последовательностей ДНК) геномов многих организмов. Уже секвенированы ДНК сотен видов бактерий, дрожжей, плазмодия, риса, кукурузы, картофеля, дрозофилы, мыши; завершена международная программа "Геном человека".
Для чего же нужно секвенирование геномов? Одна из основных задач — выяснить строение генома и его работу как единого целого. Полная нуклеотидная последовательность — это предварительная карта генома организма. В первоначальном виде это просто длинная последовательность нуклеотидов, ни о чем не говорящая. Для того чтобы с ней можно было работать, в ней выявляют гены, регуляторные элементы, мобильные элементы и другие последовательности ДНК, функция которых еще не известна. Для медицинской генетики важно нанести на нуклеотидную карту гены, ответственные за различные болезни, чтобы разрабатывать методы молекулярной диагностики, искать способы лечения и предотвращения заболеваний. На карту человека уже нанесены многие гены наследственных заболеваний.
|
|
Генная терапия наследственных заболеваний человека. Развитие этой перспективной области стало возможным после секвенирования генома человека. Генная терапия включает следующие этапы:
1. Получение клеток от больного (в генной терапии разрешено использовать только соматические клетки человека).
2. Введение в клетки лечебного гена для исправления генетического дефекта.
3. Отбор и размножение "исправленных" клеток.
4. Введение "исправленных" клеток в организм пациента.
Впервые успешно применить генную терапию удалось в 1990 г. Четырехлетней девочке, страдающей тяжелым иммунодефицитом (дефект фермента аденозиндезаминазы), были введены собственные лимфоциты со встроенным нормальным геном аденозиндезаминазы. Лечебный эффект сохранялся в течение нескольких месяцев, после чего процедуру пришлось регулярно повторять, поскольку исправленные клетки, как и другие клетки организма, имеют ограниченный срок жизни. В настоящее время генную терапию используют для лечения более десятка наследственных заболеваний, в т. ч. гемофилии, талассемии, муковисцидоза.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Для получения целевой ДНК в достаточных для работы количествах в ГИ широко используется метод ПЦР, разработанный в 1985 г. Метод позволяет размножить в миллионы раз любой участок ДНК размером до 5 тысяч пар нуклеотидов (см. с. 142). Первым практическим использованием ПЦР была разработка тест-системы для диагностики серповидноклеточной анемии (нарушенные участки ДНК размножали до обнаружимых при электрофорезе количеств). С помощью ПЦР получают фрагменты ДНК для клонирования, секвенируют целевые ДНК, выявляют патогенные вирусы или бактерии, а также наследственные заболевания и аномалии. В судебной медицине ПЦР используют для идентификации личности, для установления родственных связей. В настоящее время метод ПЦР стал обыденной процедурой, повседневно используемой в тысячах лабораторий.
Таким образом, разработка методов ГИ и ПЦР привела к бурному прогрессу в биологии, но самые глубокие преобразования произошли в биотехнологии.
Биотехнология — отрасль науки, занимающаяся промышленным использованием биологических процессов и живых организмов для производства лекарств и вакцин, сельскохозяйственных и потребительских продуктов.
Биотехнологические процессы люди использовали издревле, занимаясь хлебопечением, виноделием, пивоварением, приготовлением кисломолочных продуктов. Сущность этих процессов была выявлена лишь в XIX в. после научных открытий Л. Пастера. Работы ученого послужили развитию различных производств с использованием микроорганизмов.
В конце 1970-х гг. на стыке традиционной биотехнологии и ГИ возникла молекулярная биотехнология. В ее основе лежит процедура переноса генов из одного организма в другой посредством методов ГИ с целью создания принципиально нового продукта или промышленного производства уже известного продукта. Первая фирма, производящая лекарственные соединения с помощью методов ГИ, была создана в 1976 году.