Инициация транскрипции
Транскрипция инициируется при образовании стабильного комплекса между холоферментом и специфической последовательностью, называемой промотором и располагающейся в начале всех транскрипционных единиц. Изучение нуклеотидной последовательности более чем 50 разных промоторных сайтов прокариот и мутационный анализ выявили только два консервативных участка, по-видимому играющих ключевую роль в узнавании им функционировании промотора. Одна из этих последовательностей состоит из 6-7 пар оснований и расположена примерно на расстоянии примерно 10 оснований до того нуклеотида, с которого начинается транскрипция (+1); этот сигнал обычно обозначают как – 10-последовательность, или Прибнов-бокс – в честь ее открывателя. Сравнительный анализ – 10-последовательностей примерно пятьдесят промоторов прокариот показал, что все они немного отличаются от консенсус-последовательности ТАТАА Т (прозрачка 8). Подчеркнутая Т присутствует почти во всех промотороах, тогда как по другим позициям в каждом промоторе может наблюдаться от одного до нескольких вариантов.
Вторая последовательность, длина которой обычно равна девяти нуклеотидам расположена на расстоянии примерно 35 оснований до сайта инициации (35-последовательность) и также встречается в большинстве промоторов прокариот. Нуклеотидная последовательность сегмента между – 35- и – 10- участками не является критической, важно лишь расстояние между этими участками. – 35-последовательность участвует в связывании РНК-полимеразы, которое предшествует перемещению фермента в Прибнов-бокс. Возможно, РНК-полимераза вызывает локальное раскручивание спирали, начиная этот процесс с Прибнов-бокса, и создает условия для инициации синтеза РНК (прозрачка 9).
Остается открытым вопрос, достаточно ли простого связывания РНК-полимеразы с промотором для локального расхождения цепей вблизи сайта инициации синтеза РНК или РНК-полимераза расплетает спираль в стартовом сайте. Независимо от механизма образование «открытого» промоторного комплекса позволяет РНК-полимеразе осуществить спаривание первого и второго рибонуклеозидтрифосфатов с матричной цепью и катализировать образование первой фосфодиэфирной связи.
Различия в эффективности транскрипции индивидуальных генов отчасти зависят от структуры их промоторов:
- конкретная нуклеотидная последовательность – 35-участка определяет прочность взаимодействия РНК-полимеразы с промоторной последовательностью
- конкретная нуклеотидная последовательность – 10-участка определяет эффективность образования «открытого» промоторного комплекса
мутации в этих участках приводят к значительным изменениям способности многих промоторов обеспечивать инициацию транскрипции
- если промотор малоэффективен, то инициация транскрипции облегчается включением белков вблизи с – 35- последовательностью, именно они увеличивают вероятность того, что она будет обнаружена РНК-полимеразой и свяжется с ней; кроме того, связывание белков-активаторов может привести также к изменению структуры ДНК и тем самым способствовать инициации транскрипции
- повышению или снижению эффективности некоторых промоторов может способствовать изменение топологической структуры ДНК (например, увеличение числа отрицательных сверхвитков)
Терминация транскрипции и отделение цепей РНК
Последовательности ДНК, являющиеся сигналами остановки транскрипции, называются транскрипционными терминаторами. Обнаружено два типа сигналов терминации – ρ-зависимый и ρ-независимый терминаторы. Оба они имеют некоторые общие признаки (прозрачка 11). И тот и другой содержат инвертированные повторы, благодаря чему 3`-концы РНК-транскриптов складываются с образованием шпилек разной длины. Стебли шпилек ρ-независимых терминаторов обычно содержат ГЦ-богатые участки; один из них находится вблизи основания стебля, и к нему примыкает участок, состоящий из 4-6- У и 1-2- А-остатков. В стебле ρ-зависимых терминаторов, напротив, содержится лишь несколько ГЦ-пар (а иногда и не содержится вообще), а У-3`-концы могут отсутствовать. Точный механизм ρ-независимой и ρ-зависимой терминации транскрипции является пока предметом дискуссий. Наиболее вероятно следующее объяснение ρ-независимой терминации: РНк-полимераза останавливается после транскрипции инвертированного повтора потому, что шпилечная структура оказывается помехой. В результате сразу после остановки процесса РНК отделяется от матричной цепи вблизи У-богатого участка, который относительно слабо связан с А-богатым участком матрицы. Этим, по-видимому, объясняется то обстоятельство, что наиболее часто на конце цепи РНК находятся У-или А-остатки.
ρ – это олигомерный белок, прочно связывающийся с РНК и в этом состоянии гидголизующий АТФ до АДФ и неорганического фосфата. В одной их моделей действие ρ-белка объясняется тем, что он связывается с синтезируемой цепью РНК и перемещается вдоль нее в направлении 5΄→3΄ к месту синтеза РНК; необходимая для его перемещения энергия выделяется при гидролизе АТФ (прозрачка 12). Если ρ-белок наталкивается на образующуюся в РНК шпильку, он останавливает полимеразу, которая могла бы продолжать транскрипцию. Возможно, для отсоединения РНК от матрицы достаточно этой ρ-индуцированной остановки, но не исключено, что диссоциации и отделению способствует сам ρ-белок.
Терминация транскрипции редко является абсолютно зависимой или абсолютно независимой от ρ-белка. Некоторые ρ-независимые терминаторы работают в присутствии ρ более эффективно. А в некоторых условиях так называемые ρ-зависимые терминаторы вызывают терминацию и в отсутствии ρ, хотя и не столь успешно.
Терминация, как и инициация синтеза РНК является регулируемым процессом. Существуют белки, функционирующие как антитерминаторы и предотвращающие терминацию в ρ-независимых терминаторах; известны также другие белки, ингибирующие ρ и тем самым обеспечивающие удлинение цепи после сигналов терминации. При определенных обстоятельствах молекулы РНК могут образовывать альтернативные шпилечные структуры на особых последовательностях определенных участков ДНК. Одни их таких структур могут приводить к абортивной терминации, а другие, к продолжению транскрипции.
Посттранскрипционный процессинг РНК у прокариот
Это процесс созревания, при котором первичный РНК-транскрипт модифицируется и превращается в зрелую РНК. Характер и степень модификации РНК завися от типа РНК.
Молекула мРНК у прокариот не подвергается процессингу. У некоторых бактерий транскрипция и трансляция сопряжены, т.е. происходят одновременно. 5`-конец мРНК может транслироваться на рибосоме и затем подвергаться деградации еще до завершения синтеза ее 3`-конца.
Молекулы тРНК вначале синтезируются в виде протРНК, которая примерно на 20% длиннее, чем соответствующая тРНК. Лишние последовательности, расположенные у 5`и 3`-концов, удаляются с помощью таких ферментов, как рибонуклеаза Q и P (прозрачка 17). Иногда молекула протРНК состоит из двух или более молекул тРНК, соединенных между собой (прозрачка 16). Их разделение также осуществляется с помощью рибонуклеаз. Если 3`-конец тРНК не несет концевой последовательности ЦЦА, то эти основания присоединяются при постсинтетической модификации (прозрачка 17). Все тРНК содержат минорные основания. Эта модификация происходит после завершения транскрипции.
Гены рРНК прокариот расположены в транскрипционных блоках. Три гена рРНК (прозрачка 14) E.coli (16S, 23S, 5S) располагаются вместе с генами нескольких тРНКв одном таком блоке и транскрибируются в виде одной молекулы РНК. Эти молекулы рРНК и тРНК отделены друг от друга спейсорной РНК. Ращипление первичного транскрипта на отдельные составляющие катализирует рибонуклеаза Q; поскольку этот фермент специфичен к двуцепочечной РНК, предполагают, что в области спейсеров образуются двухцепочечные шпильки (прозрачка 15), которые фермент узнает и вырезает.
Транскрипция у эукариот
РНК-полимераза I (М ~ 473 тыс., 6 субъединиц) ведет синтез крупных молекул рРНК и малых молекул, так называемой, 5,88 рРНК по ДНК ядрышка. Она — самая «работящая». На долю рРНК приходится около 80% всей РНК клетки по массе. В ядрышке же происходит и «самосборка» (но не объединение) двух субъединиц рибосомы (большой и малой) с участием рибосомальных белков, поступающих из цитоплазмы. В клетках большинства эукариотов имеются сотни идентичных копий генов рРНК расположенных рядом друг с другом.
РНК-полимераза II. Она — крупнее (М-882 тыс., 10-12 субъединиц) и выполняет самую ответственную работу — синтезирует множество различных иРНК, направляющих, в свою очередь, синтез белков в рибосомах. Хотя на долю иРНК в клетке приходится не более 2% от суммарной РНК, РНК-полимеразу II не следует считать мало продуктивным ферментом. Ведь иРНК нестабильна, легко разрушается. Считается, что время разрушения наличных молекул иРНК у бактерий составляет несколько минут. У животных — несколько часов. Но надо иметь в виду, что, по крайней мере, часть иРНК эукариотов выходит в цитоплазму клетки в комплексе с белком («информосомы»). В ряде случаев показано, что они сохраняются дольше. За время жизни клетки синтезируется множество ее сменяющих друг друга молекул, в соответствии с изменениями потребностей белкового синтеза. Молекулярные веса иРНК колеблются, — в зависимости от размеров синтезируемых белков, — в пределах от 50 тысяч до 4 миллионов дальтон. В начале транскрибированного участка иРНК находится специально закодированное посадочное место для рибосом. (При наработке нескольких копий белка рибосомы «садятся» на это место одна за другой.) РНК-полимераза II находится в нуклеоплазме
РНК-полимераза III у эукариотов (М - 653 тыс., 9 субъединиц) ведет синтез стабильных малых молекул тРНК и, так называемой, 5S рРНК. Последняя так же, как и 5,8S pPHK, входит в состав большой субъединицы рибосомы эукариотов. В рибосомах бактерий 5,85S pPHK нет. Находится в нуклеоплазме
Строение и организация единиц транскрипции у эукариот значительно сложнее, чем у прокариот. Отчасти это обусловлено использованием трех разных систем транскрипции (не считая систем транскрипции генов митохондрий и хлоропластов).
Гены класса I, кодирующие 5,8S-, 18S- и 28S рРНК, транскрибируются РНК-полимеразой I
Гены класса II, кодирующие все мРНК и ряд малых ядерных РНК (мяРНК) образуются РНК-полимеразой II.
Гены класса III, кодирующие тРНК, 5SрРНК и некоторые малые цитоплазматические РНК (мцРНК) транскрибируются РНК-полимеразой III.
В отличие от прокариотических генов, почти всегда коллинеарных своим РНК, многие гены эукариот имеют мозаичное строение (прозрачка 18): чередование кодирующих (экзоны) и некодирующих (вставочные последовательности или интроны) последовательностей в пределах единицы транскрипции. интроны чаще всего встречаются в генах, кодирующих белки и тРНК, и реже в рРНК-генах. Интронов нет только в эукариотических генах, кодирующих пять гистонов, α и β-интерфероны и белки некоторых вирусов млекопитающих. Размеры, число и местоположение интронов у разных генов различны. Обычно число интронов на ген возрастает пропорционально длине последовательности, кодирующей белок, а размеры экзонов в среднем составляют около 300 п.н. в целом общая длина интронов превышает суммарную длину экзонов в 2-10 раз. Интроны располагаются в единицах транскрипции не случайным образом. В гшенах тРНК они примыкают к петлям антикоддонов, а белок-кодирующих генах часто находятся между сегментами, которые кодируют отдельные структурные или функциональные домены белка.
Гены прокариот организованы в опероны и их экспрессия опосредуется полицистронными мРНК. В отличие от прокариот у эукариот образуются мРНК, кодирующие только один белок. Даже если ген кодирует не один вид мРНК, каждая зрелая мРНКимеет только одну транслируемую кодирующую последовательность.
Мы определяем ген как совокупность сегментов ДНК, которые вместе составляют экспрессируемую единицу, обусловливающую образование спецефического функционального продукта – либо молекулы РНК, либо полипептида. К сегментам ДНК, составляющим ген, относятся:
1. Единица транскрипции, которая представляет собой протяженный участок ДНК, кодирующий последовательность первичного транскрипта; в нее входят:
а) последовательность, кодирующая либо зрелую РНК, либо белковый продукт;
б) интроны;
в) 5`-лидерная и 3`-трейлерная последовательности, которые присутствуют в зрелых мРНК, а также промежуточные последовательности (спейсеры), которые удаляются в ходе процессинга первичных транскриптов генов, кодирующих РНК.
2. Минимальные последовательности, необходимые для начала правильной транскрипции (промотор) и для образования правильного 3`-конца зрелой РНК
3. Последовательности, регулирующие частоту инициации транскрипции; к ним относятся последовательности, ответственные за индуцибельность и репрессию транскрипции, а также клеточную, тканевую и временную специфичность транскрипции. к их числу относятся энхансеры и сайленсеры – последовательности, которые оказывают дистанционное влияние на инициацию транскрипции независимо от своей ориентации относительно точки начала транскрипции.
Для инициации транскрипции с участием трех разных РНК-полимераз используются разные регуляторные последовательности, при этом последние располагаются каждая на определенном расстоянии от точки начала транскрипции. Кроме того, для РНК-полимеразы каждого типа требуются свои вспомогательные белки (факторы транскрипции), которые связываются с этими регуляторными последовательностями.
Для включения и выключения транскрипции эукариотических структурных генов используется множество разнообразных высокоспецифичных процессов. Многие из факторов транскрипции связываются непосредственно с нуклеотидной последовательностью длиной менее 10 п.н., называемые по-разному: боксом, модулем, элементом инициации, регуляторным элементом. В отличие от прокариот у эукариот опероны в большинстве своем отсутствуют, т.е. каждый эукариотический структурный ген имеет свой собственный набор регуляторных элементов. Существенную роль в регуляции транскрипции у эукариот играет также белок-белковое взаимодействие.
Несмотря на индивидуальность набора регуляторных элементов у структурных генов эукариот, каждый из них имеет промоторный участок (ТАТА-бокс или бокс Хогнесса) из восьми нуклеотидов, включающий последовательность ТАТА; последовательность ЦЦААТ (ЦАТ-бокс); участок из повторяющихся динуклеотидов ГЦ (ГЦ-бокс). Эти элементы находятся на расстоянии 25, 75 и 90 п.н. от сайта инициации соответственно (прозрачка 21). Транскрипция структурного гена эукариот начинается со связывания с ТАТА-боксом фактора транскрипции IID (TFIID), который представляет собой комплекс из примерно 14 белков. Затем с TFIID и участками ДНК примыкающими к ТАТА-боксу связываются другие факторы транскрипции и, наконец, со всем этим транскрипционным комплексом связывается РНК-полимераза II. Затем при участии дополнительных факторов происходит инициация транскрипции в точке +1 (прозрачка 19). Ясно, что если последовательности ТАТА отсутствует, или сушественно изменена, то транскрипция структурного гена становится невозможной. Идентифицированы также факторы транскрипции специфичные для регуляторных элементов ЦЦААТ и ГЦ, но пока не ясно, как ДНК-белковые взаимодействия могут влиять в этом случае на эффективность транскрипции, если элементы расположены на расстоянии более 75 п.н. от сайта инициации. Кроме того, на расстоянии сотен и даже тысяч пар оснований от сайта инициации находится так называемая энхансерная последовательность, которая многократно повышает скорость транскрипции структурных генов. По-видимому, сближение удаленных регуляторных элементов и соответствующего структурного гена происходит при укладке хромосомной ДНК. Кроме того, факторы транскрипции, которые связываются с определенными энхансерами и регуляторными элементами, могут образовывать цепочку, соединяющую удаленные друг от друга сайты.
Некоторые репрессированные (не эксперессирующиеся) гены активируются каскадом событий, который запускается каким-либо специфическим внеклеточным сигналом, например, повышением температуры, или синтезом гормона. Гормон, поступив в кровоток, связывается с рецепторами специфических клеток, облегчающими его проникновение в клетку. Оказавшись в клетке, гормон вступает во взаимодействие с одним из клеточных белков и изменяет его конформацию. В таком измененном состоянии белок проникает в ядро и связывается со специфическим регуляторным элементом, который инициирует транскрипцию соответствующего гена.
Существуют также белки, которые, взаимодействуя с регуляторными элементами блокируют транскрипцию. Например, известен класс генов позвоночных (примерно 18), активно транскрибирующихся только в нервных клетках. Каждый их этих генов имеет регуляторный элемент из 24 п.н., находящийся «левее» сайта +1; он обозначается NRSE (от англ. Нейрон рестректив. Силенцер. элемент). Во всех клетках, кроме нейронов, синтезируется NRSF-фактор, который связывается с NRSE и блокирует транскрипцию соответствующих генов. В нейронах NRSF не синтезируется, и упомянутые гены активно транскрибируются.
Таким образом, структурный ген может иметь множество регуляторных элементов, которые активируются специфическими сигналами в клетках разного типа в разное время клеточного цикла. В синтезе РНК также выделяют стадии инициации, элонгации и терминации, но в этих процессах часто принимают участие другие ферменты и последовательности оснований, чем у прокариот, однако первыми основаниями, включаемыми в РНК при инициации, являются, как и у прокариот, А или Г.