Г. Эксперимент Альфреда Херши и Марты Чейз

Лекция 1. Структура геномов про- и эукариот. Генетический код

Г. Опыты Фредерика Гриффита

Гриффит работал с пневмококками - бактериями, вызывающими пневмонию. Он брал два штамма пневмококков: капсульный и бескапсульный. Капсульный - патогенный (вирулентный), при инфицировании таким штаммом мыши погибают, бескапсульный - непатогенный. При введении мышам смеси убитых нагреванием (и, следовательно, потерявших вирулентность) капсульных пневмококков и живых бескапсульных невирулентных бактерий, животные погибали в результате размножения капсульных вирулентных форм. Обнаруженное явление Гриффит интерпретировал как трансформацию.

В 1944г. этот эксперимент был повторен Освальдом Эйвери, Колином Мак-Леодом и Маклином Мак-Карти в варианте смешивания бескапсульных пневмококков с взятыми от капсульных белками, полисахаридами или ДНК. В результате этого эксперимента была выявлена природа трансформирующего фактора.

Трансформирующим фактором оказалась ДНК.

г. Эксперимент Альфреда Херши и Марты Чейз

Фаги (бактериофаги) - это вирусы, размножающиеся в бактериях.

E. сoli - кишечная палочка (эубактерия).

Суть опыта: фаги, у которых белковая оболочка была мечена радиоактивной серой (S35), а ДНК - радиоактивным фосфором (Р32), инкубировали с бактериями. Затем бактерии отмывали. В смывных водах не обнаруживали Р32, а в бактериях - S35 Следовательно, внутрь попала только ДНК. Через несколько минут из бактерии выходили десятки полноценных фагов, содержащих и белковую оболочку, и ДНК.

Отсюда следовал однозначный вывод о том, что именно ДНК выполняет генетическую функцию - несет информацию как о создании новых копий ДНК, так и о синтезе фаговых белков 1957г. Опыты Френкеля – Конрата

Френкель-Конрат работал с вирусом табачной мозаики (ВТМ). В этом вирусе содержится РНК, а не ДНК. Было известно, что разные штаммы вируса вызывают разную картину поражения листьев табака. После смены белковой оболочки "переодетые" вирусы вызывали картину поражения, характерную для того штамма, чья РНК была покрыта чужим белком.

Следовательно, не только ДНК, но и РНК может служить носителем генетической информации

Молекулярная биология - это наука о механизмах хранения, воспроизведения, передачи и реализации генетической информации, о структуре и функциях нерегулярных биополимеров - нуклеиновых кислот и белков.

Нуклеотиды

Принципы строения ДНК

1. Нерегулярность.

Существует регулярный сахарофосфатный остов, к которому присоединены азотистые основания. Их чередование нерегулярно.

2. Антипараллельность.

ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, ориентированных антипараллельно. 3`-конец одной расположен напротив 5`- конца другой.

3. Комплементарность(дополнительность).

Каждому азотистому основанию одной цепи соответствует строго определенное азотистое основание другой цепи. Соответствие задается химией. Пурин и пиримидин в паре образуют водородные связи. В паре A-Т две водородные связи, в паре Г-Ц - три.

4. Наличие регулярной вторичной структуры.

Две комплементарные, антипараллельно расположенные полинуклеотидные цепи образуют правые спирали с общей осью.

Формы двойной спирали ДНК

В основной - В-форме на виток приходится 10 комплементарных пар. Плоскости азотистых оснований перпендикулярны оси спирали. Соседние комплементарные пары повернуты друг относительно друга на 36 . Диаметр спирали 20Å, причем пуриновый нуклеотид занимает 12Å, а пиримидиновый - 8Å. А-форма - 11 пар азотистых оснований на виток. Плоскости азотистых оснований отклонены от нормали к оси спирали на 20 . Отсюда следует наличие внутренней пустоты диаметром 5Å. Высота витка 28Å. Такие же параметры у гибрида из одной цепи ДНК и одной цепи РНК.

С-форма - шаг спирали 31Å, 9.3 пар оснований на виток, угол наклона к перпендикуляру 6 .

Все три формы - правозакрученные спирали.

Есть еще несколько форм правых спиралей и всего одна левая спираль (Z -форма). Высота витка в Z-форме -44.5 Å, на виток приходится 12 пар нуклеотидов. Ни А-, ни Z- формы не могут существовать в водном растворе без дополнительных воздействий (белки или суперспирализация).

Отличия между ДНК и РНК

Сюрпризы митохондриального генома

Несмотря на то, что в геномах митохондрий млекопитающих и дрожжей содержится приблизительно одинаковое количество генов, размеры дрожжевого генома в 4-5 раз больше — около 80 тыс. пар нуклеотидов. Хотя кодирующие последовательности мтДНК дрожжей высоко гомологичны соответствующим последовательностям у человека, дрожжевые мРНК дополнительно имеют 5'-лидерную и 3'-некодирующую области, как и большинство ядерных мРНК. Ряд генов содержит еще и интроны. Так, в гене box, кодирующем цитохромоксидазу b, имеется два интрона. Из первичного РНК-транскрипта автокаталитически (без участия каких-либо белков) вырезается копия большей части первого интрона. Оставшаяся РНК служит матрицей для образования фермента матуразы, участвующей в сплайсинге. Часть ее аминокислотной последовательности закодирована в оставшихся копиях интронов. Матураза вырезает их, разрушая свою собственную мРНК, копии экзонов сшиваются, и образуется мРНК для цитохромоксидазы b. Открытие такого феномена заставило пересмотреть представление об интронах, как о “ничего не кодирующих последовательностях”.

Сверхспирализация.

Образование сверхспиральной ДНК происходит во всех прокариотических и эукариотических клетках и во многих вирусах, поражающих эукариот. Сверх спиральная (сверхскрученная) ДНК образуется при введении в двойную спираль ДНК дополнительных витков (сверхвитков). В результате в молекуле возникает напряжение, которое проявляется, в частности в том, что ось двойной спирали сама закручивается в спираль (спирализуется) – см. на примере кольцевой замкнутой двуцепочечной ДНК (прозрачка). Полученная таким образом суперспиральная ДНК должна быть стабилизирована, поскольку в результате более плотной упаковки отрицательно заряженные фосфатные группы оказываются в непосредственной близости друг от друга. Взаимное отталкивание их компенсируется путем связывания их с положительно заряженными белками (есть не у всех вирусов, но у всех про-и-эукариотах) и с малыми молекулами, представляющими собой полиамины, например, спермидин (их нет только в вирусах).

Упаковка ДНК в клетках прокариот.

Сверхспиральный участок ДНК в комплексе с гистоноподобными белками, обладающими сродством к ДНК, и полиаминами образует «бусину» диаметром около 12 нм. Внутри бусины ось двойной спирали ДНК перекручена и образует примерно 6 витков. Бусины соединены между собой участками ДНК, в которых сверхспиральность отсутствует, и объединяются таким образом в структуру, напоминающую ожерелье. Такая ДНК образует далее большие петли, которые стабилизируются и окончательно конденсируются благодаря взаимодействию с соответствующими белками и РНК.

Упаковка ДНК в клетках эукариот

Включает в себяассоциацию сверхспирализованной ДНК с различными белками (гистонами –основные белки, 11,3-21 кДа, внутри бусины Н2А, Н2В, Н3 и Н4), в результате которой образуется комплекс, называемый хроматином. Хроматин в свою очередь образует соленоидоподобную структуру, с которой связываются хромосомные структурные белки ( они образуют каркас на котором идет окончательная конденсация хроматина, этот белковый остов не разрушается даже после удаления всех гистонов ); получившийся в результате комплекс – хромосома.

Хроматин состоит из двуцепочечной ДНК, которая обвивается вокруг гранул, состоящих из гистонов. Такая структура похожая на бусы – хроматиновое волокно. Каждая бусина – это нуклеосома ( диаметр ее около 10 нм, впервые установил ее структуру Клуг с сотрудниками ). Нуклеосомы соединяются с помощью гистона Н1, ДНК этих связующих участков – соединительная (или линкерная) ДНК. Н1 не участвует в стабилизации структуры хромосомы, а скорее играет роль в регуляции транскрипционной активности хроматина. В результате конденсации в хроматин продольные размеры ДНК уменьшаются в 5-6 раз.

Топоизомеразы. Переходы в молекулах ДНК, связанные с изменением степени сверхспирализации (топологические изомеры ДНК), катализируются ферментами топоизомеразами. Одни топоизомеразы вызывают релаксацию сверхспиральной ДНК, а другие напротив, приводят к появлению в ней сверх витков. Так например, ДНК-гираза E. Coli переводит двуцепочечную кольцевую ДНК в состояние с отрицательной сверхспирализацией. Это необходимо для снятия положительных сверхвитков, возникающих при репликации (и транскрипции) из-за раскручивания двойной спирали ДНК. (см. действие антибиотиков).

Гены. Структурный ген – это наименьший отрезок ДНК или РНК, кодирующий полную аминокислотную последовательность какого-либо белка. В клетке высших организмов может содержаться до 100 000 генов (по последним данным их существенно меньше). Однако ДНК в клетке столько, что ее хватило бы на образование в 10 раз большего числа генов. «лишняя ДНК» - в составе интронов, спейсерной ДНК, например. В вирусах может быть лишь 5-6 генов, а геном прокариот составляет примерно 0,1% от генома высших.

Хромосома прокариот. Структурные гены подразделяются на три основных типа: независимые гены (транскрибируются без каких-либо механизмов регуляции транскрипционной активности), транскрипционные единицы (транскриптоны – группа следующих друг за другом генов, транскрибируемых совместно, обычно это гены белков или н.к., связанных между собой в функциональном отношении), и опрероны (группа следующих подряд структурных генов, находящихся под контролем участка ДНК - оператора). Кроме того в прокариотической клетке могут находиться более мелкие реплицирующиеся единицы – плазмиды (кольцевые молекулы ДНК, в них есть участки способные к перемещению – транспозоны, они часто содержат гены резистентности к антибиотикам, перемещаясь из одной клетки в другую в процессе коньюгации, гены резистентности быстро распространяются в популяции бактерий).

Клетки эукариот используют в качестве генетического материала лишь двуцепочечную ДНК. Структурные гены в них подразделяются на независимые гены (их транскрипция не связана с транскрипцией других генов, их активность регулируется, например гормонами), повторяющиеся гены (например, ген рибосомной 5S-РНК повторятся много сотен раз, причем повторы следуют вплотную друг за другом) и кластерные гены (это локализованные в определенных участках – локусах – хромосомы группы различных генов с родственными функциями, иногда также в виде повторов, например, кластер гистоновых генов в геноме человека повторяются 10-20 раз). В кодирующие последовательности этих генов могут вклиниваться некодирующие – интроны (разбивают кодирующую – экспрессируемую часть гена – следовательно для полученной с этой матрицы мРНК нужен сплайсинг). Кроме того, между генами могут находиться участки ДНК с большим числом повторов (сателлитной ДНК – в теломерных и центромерных участках хромосомы – функция этой ДНК пока неясна, вероятно структурная) и спейсерной ДНК (располагается между генами), транскрибируемой и нетранскрибируемой.

Неядерные геномы. ДНК митохондрий и хлоропластов.

Отличительная особенность клеток эукариот состоит в том, что часть генетической информации у них заключена в молекулах, находящихся вне хромосом, локализованных в ядре. Существует два таких типа цитоплазматических ДНК: одни – в митохондриях эукариот, другие – в хлоропластах зеленых растений и водорослей. Как и все цитоплазматические элементы, они наследуются по материнской линии, а не по законам Менделя.

ДНК митохондрий. Это замкнутые кольцевые сверхспиральные дуплексные ДНК (прозрачка). Размер у животных около 20 т.п.н., у дрожжей – 80 т.п.н., у растений – от нескольких сотен до нескольких тысяч т.п.н. Митохондриальная ДНК эволюционирует быстрее, чем ядерная, и мутации в ней происходят почти в десять раз чаще. Рассмотрим на примере митохондриальной ДНК дрожжей. Есть гены, кодирующие белки, гены кодирующие РНК, вставочные последовательности, есть сайты начала репликации, кодирующие субединицы АТФ-азного комплекса.

ДНК хлоропластов сходна с ДНК митохондрий. Эта ДНК – кольцевой дуплекс (прозрачка), содержащий какое-то количество (но далеко не все) генов, существенных для функционирования (например, кодирование фрагмента ключевого фермента фотосинтеза – рибулозо-1,5-бифосфат карбоксилаза) и поддержания структуры хлоропластов, и имеет достаточно большую длину – 120-180 т.п.н. в отличие от ДНК митохондрий в пределах вида довольно консервативна.

Есть примеры межгеномного обмена: перенос сегментов хлоропластной ДНК в ядерную ДНК, митохондриальной ДНК в ядерную ДНК (дрожжи, саранча, крыса), хлоропластной ДНК в митохондриальную ДНК. Механизм таких переносов пока не установлен.