Определение активности солодовых амилаз.

В проросшем зерне пшеницы, ржи, ячменя содержатся активные α- и β-амилазы. Они хорошо растворяются в воде и могут быть получены в виде водной вытяжки.

Ферменты α- и β-амилазы проявляют свою активность в несколько разных условиях температуры и реакции среды. На этом основано их разделение. β-Амилаза разрушается при нагревании до 70^оС, тогда как α-амилаза при этой температуре сохраняет свою активность. α-амилаза проявляет наибольшую активность в слабокислой среде, при рН 6,3 – 5,6. При более кислой реакции (при рН 4,8 – 3,3) этот фермент разрушается. Фермент β-амилаза в кислой среде не инактивируется. Он имеет оптимум действия при рН 4,8.

Испытуемый материал: солод.

Реактивы: соляная кислота С(HCl)=0,1 моль/дм³

соляная кислота ω(HCl) =20 %

гидрофосфат натрия С(Na₂HPO₄) = 0,15 моль/ дм³

раствор йода

раствор крахмала ω =2 %

буферный раствор с рН = 5,6

сернокислая медь ω (CuSO₄) = 6 %

едкий натр ω (NaOH) = 1,25 %

сернокислая медь (раствор Фелинга I) ω (CuSO₄) = 4 %

щелочной раствор сегнетовой соли (раствор Фелинга II)

раствор железоаммиачных квасцов

раствор перманганата калия С(1/5 KMnO₄ ) = 0,1 моль/ дм³

Выделение α- и β-амилаз солода.

Навеску измельченного солода 20 г смешивают со 100 см³ дистиллированной воды в фарфоровом стакане или колбе и беспрерывно перемешивают в течение 15 мин. Затем всю массу оставляют на 30 мин на льду или в холодной воде. По истечении этого времени снова производят перемешивание, после чего массу отжимают через ткань и фильтруют через сухой складчатый фильтр или центрифугируют. Вытяжка из солода содержит α- и β-амилазы.

α-Амилаза может быть изолирована из вытяжки солода при следующих условиях: 10 см³ солодовой вытяжки в пробирке прогревают на водяной бане при 70⁰С в течение 15 минут (указанная температура должна строго соблюдаться), после чего раствор охлаждают и берут на исследование активности α-амилазы. β-амилаза при указанной температуре инактивируется.

β-амилаза может быть изолирована из солодовой вытяжки путем инактивирования α-амилазы в кислой среде. Для этого поступают так: 15 см³ солодовой вытяжки вносят в стаканчик, добавляют 3 см³ раствора соляной кислоты с концентрацией 0,1 моль/дм³ и 12 см³ воды с тем, чтобы общий объем составлял 30 см³ (рН при этом должен быть 3,3) и оставляют на льду или в холодильнике на 15 мин.

По истечении этого времени к раствору добавляют 6 см³ раствора гидрофосфата натрия С(Na₂HPO₄) = 0,15 моль/дм³ для того, чтобы довести рН до 6,0. в дальнейшем этот раствор берут для определения осахаривающей способности β-амилазы.

Опыт 1. Определение декстринирующей способности α-амилазы.

При действии на крахмал α-амилазы образуется большое количество декстринов разного молекулярного веса, по-разному окрашивающихся йодом.

В зависимости от окраски с йодом различают следующие промежуточные продукты расщепления крахмала:

1. Амилодекстрины окрашиваются йодом в сине-фиолетовый цвет, осаждаются спиртом, вращают плоскость поляризации на + 196⁰, восстанавливают реактив Фелинга на 1% по отношению к мальтозе, по своему строению близки к крахмалу. Средний молекулярный вес около 10000.

2. Эритродекстрины окрашиваются йодом в красно-бурый цвет, осаждаются спиртом, вращают плоскость поляризации на 194⁰, восстанавливают раствор Фелинга на 2-3 %. Средний молекулярный вес 6000- 4000.

3. Ахродекстрины почти не окрашиваются йодом, растворяются в 70 %-ном спирте, вращают плоскость поляризации на 192⁰, обладают 10 %-ной восстанавливающей способностью по отношению к мальтозе. Средний молекулярный вес 3700.

4. Мальтодекстрины не окрашиваются йодом, не осаждаются спиртом, вращают плоскость поляризации на 183⁰, обладают восстанавливающей способностью на 30-40 % по отношению к мальтозе.

Метод определения декстринирующей способности α-амилазы основан на качественной пробе с йодом. В шесть пробирок, установленных в штативе, вносят по 5 см³ 2 %-ного раствора растворимого крахмала. Затем в каждую пробирку добавляют по 1 см³ буферного раствора с рН =5,6; ферментный раствор и воду вносят в количествах, указанных в приведенной таблице:

Растворы в пробирках тщательно смешивают и ставят в термостат или водяную баню при 40⁰С. Глубину гидролиза крахмала контролируют по четвертой пробирке. Для этого из нее стеклянной палочкой периодически отбирают пробы по несколько капель жидкости на белую кафельную плитку или фарфоровую чашечку и к ней добавляют каплю раствора йода. Первый отбор пробы делают через 5 минут после начала термостатирования. Частота отбора проб зависит от активности фермента и скорости гидролиза крахмала. Термостатирование продолжают до тех пор, пока проба из четвертой пробирки не дает красно-бурого окрашивания с йодом, что свидетельствует об образовании в этой пробирке эритродекстринов.

После этого в каждую пробирку добавляют по несколько капель раствора йода. Если хотят остановить гидролиз крахмала, то добавляют еще по 2-3 капли 20%-ной соляной кислоты. Содержимое пробирок окрашивается в разные цвета: от синего – в первой пробирке с неизмененным крахмалом через фиолетовый, красно-бурый до желтого. Следует указать, исходя из окраски с йодом, до каких декстринов шел гидролиз крахмала в каждой пробирке в зависимости от количества внесенного фермента.

Опыт 2. Определение осахаривающей способности β-амилазы

В мерную колбу на 100 см³ вносят 50 см³ 2%-ного раствора растворимого крахмала и 5 см³ фосфатного буфера с рН-5,6. содержимое пробирки прогревают в водяной бане при 40⁰ С в течение 15 минут. Затем в колбу вносят 5 см³ ферментного препарата β-амилазы. Раствор в колбе перемешивают и снова ставят в водяную баню при той же температуре на 30 минут. По истечении этого времени ферментативный процесс гидролиза крахмала останавливают путем добавления 10 см³ раствора сернокислой меди ω(CuSO₄) = 6 %. После этого раствор охлаждают до комнатной температуры и доводят водой до метки. Количественное определение сахаров производят по методу Бертрана. Пересчет сахаров ведут на мальтозу, как на основной продукт распада крахмала при действии β-амилазы. Мерой активности β-амилазы служит количество разложившегося крахмала, выраженное в процентах от его первоначального веса.

Опыт 3. Влияние температуры на активность β-амилазы

Температура оказывает большое влияние на скорость ферментативной реакции. При низких температурах (0-4⁰С) ферментативные реакции протекают с очень малой скоростью. Температура выше 60⁰С вызывает инактивацию большинства ферментов. Температурный оптимум многих ферментов лежит в пределах 40-50⁰С.

Опыты ставят при температурах 4⁰С (холодильник), 20⁰ С (комнатная), 40⁰С и 60⁰С (водяная баня). Для получения хороших результатов необходимо строго выдерживать условия проведения анализа и в течение всего опыта поддерживать заданную температуру.

В мерную колбу на 100 см³ вносят 50 см³ 2 %-ного раствора крахмала и 5 см³ фосфатного буфера с рН 5,6. Содержимое колбы доводят до заданной температуры (нагревают или охлаждают), после чего вносят 5 см³ ферментного препарата, предварительно термостатированного при той же температуре и замечают время. Гидролиз продолжается 30 минут, в течение которых строго следят за поддержанием постоянной температуры. Через 30 минут в колбу вносят 10 см³ раствора сернокислой меди ω(CuSO₄) = 6 % для прекращения действия фермента, содержимое колбы охлаждают и доводят водой до метки. Количество образовавшейся мальтозы определяют методом Бертрана. Полученные результаты сводят в таблицу и строят график, характеризующий влияние температуры на активность β-амилазы.

Опыт 3. Влияние рН на осахаривающую способность солодовых амилаз

Каждый фермент проявляет свою активность в определенной зоне рН. Для определения влияния рН среды на осахаривающую способность солодовых амилаз проводится коллективная работа. Опыты ставят при постоянной температуре, но разных значениях рН (2,6; 4,4; 5,0; 5,8;7,0;8,0 и др.).

В мерную колбу на 100 см³ вносят 50 см³ 2 %-ного раствора крахмала и 5 см³ соответствующей буферной смеси. Содержимое колбы прогревают в термостате или водяной бане до 40⁰С, после чего вносят 5 см³ фермента, предварительно термостатированного при той же температуре. Продолжительность гидролиза 30 минут. Реакцию прекращают добавлением 10 см³ 6%-ного раствора сернокислой меди, после этого колбу охлаждают, и объем смеси доводят водой до метки. Образовавшуюся под действием амилаз мальтозу определяют методом Бертрана.

Полученные результаты сводят в таблицу и строят график, характеризующий влияние реакции среды на активность ферментов.

Опыт 4. Влияние рН на декстринирующую способность солодовых амилаз

Для выяснения влияния рН на декстринирующую способность амилаз берут 10 пробирок и наливают в каждую по 2,5 см³ буферных растворов, состоящих из следующих количеств 0,2 М раствора Na₂HPO₄ и 0,1 М лимонной кислоты.

Затем в каждую пробирку приливают по 5 см³ 2 %-ного раствора крахмала и по 2,5 см³ экстракта солода (экстракт следует приливать, начиная с 1-ой пробирки, через равные промежутки времени – 30 сек). Содержимое пробирок после приливания экстракта тщательно перемешивают и оставляют на 10 минут. По прошествии этого времени берут через каждую минуту пробу (2-3 капли) из седьмой пробирки и добавляют две капли йода. Спустя 2 минуты после того, когда содержимое этой пробирки будет давать красно-бурое окрашивание, во все пробирки добавляют по несколько капель йода и взбалтывают. Раствор йода следует приливать, начиная с первой пробирки, через равные промежутки времени, т.е. через 30 секунд.

На основании полученной окраски содержимого пробирок можно судить о степени расщепления крахмала в зависимости от рН. Там, где получилась слабо-желтая окраска, крахмал расщепился полностью, и, следовательно, рН был оптимальным.

Вопросы к защите лабораторных работ

1) Что представляют собой ферменты?

2) В чем заключается каталитическая функция ферментов?

3) Что такое энергия активации?

4) Объясните механизм ферментативного катализа.

5) Из чего состоят ферменты?

6) Чем отличаются ферменты от неорганических катализаторов?

7) Как зависит активность ферментов от: температуры реакции, кислотности среды, концентрации субстрата?

8) Что такое активаторы ферментов? Какие Вы знаете виды активаторов?

9) Что такое ингибиторы? Их классификация.

10) Что Вы понимаете под специфичностью действия ферментов? Какие вы знаете виды специфичности?

11) На какие классы и по какому принципу подразделяют ферменты?

12) Какие Вы знаете ферменты: а) 1 класса, входящие в состав зерна и продуктов его переработки; б) 2 класса; в) 3 класса? Охарактеризуйте их.

Лабораторная работа № 7